基因插入位點和模式實驗（二）

3. 跨世代 Southern 分析

Southern 分析一般用于鑒定各個轉基因插入位點的排列形式（見 3 .2 節中“ Southern分析” ）。當然，通過對不同世代轉基因植株雜交檢測結果的比較，它也可以用于轉基因插入位點數的測定。例如，根 據 T。代和自交所得到凡代植株的 Southern 分析結果就可以判定外源基因的插入位點數。以事例 2 為例，下面具體介紹這種方法。

( 1 ) 樣品的 DNA 可以按照 DNA 提取試劑盒推薦的方法從植株葉片中抽提（見注3 ) ，DNA 的濃度根據所提樣品在波長為 260 nm 的吸光值推算。樣品提好后可以放在 4℃ 短時保存，也可以長期存儲在 -20℃ 中（見注4 ) 。

( 2 ) 用于 Southern 分析的 DNA 量主要根據每個作物基因組的大小而定，一般水稻為 5 μg，大麥和小麥則需要 20 μg。DNA 樣品消化時，反應體積為 50~80 μl，限制性內切核酸酶的用量為 10~15 U/μg DNA ( 見注5 ) 。另外，進行樣品 DNA 消化時應同時消化陰性對照（即野生型）和陽性對照（如已經過 Southern 分析鑒定為陽性的單株）的 DNA。

( 3 ) 酶切消化后的反應液先用真空離心機濃縮到約 30 μl 的體積，然后加入到濃度為 0.8% 的瓊脂糖凝膠中（用 1x 的 TBE 熔化），在 40 V 的電壓下電泳過夜。同時凝膠中還應該加入1 或 2 種標記 （如 600 ng 的用 Pst I 或者 HindⅢ 酶切后的 λ 噬菌體 DNA 產物）。另外，在空白點樣孔上還應加入限制酶的反應緩沖液以避免電泳時有可能發生的帶偏差。

( 4 ) 電泳完畢后，用溴化乙錠染好的凝膠在紫外燈下拍下照片，以便于確定 DNA 的酶切消化程度和各個樣品點樣時的均一度，同時記錄標記的各個條帶在凝膠中的位置。

( 5 ) 凝膠先用 0.25 mol/L HCl 溶液（緩慢搖動）洗 15 min 后再用水沖洗，然后在 0.4 mol/L NaOH 溶液中變性 15 min 后，將 DNA 樣品過夜印跡到尼龍膜上。轉印完成后 ，將尼龍膜放入 2X SSC 溶液中洗 2 min，再用薄膜包好放在 5℃ 下短期保存或者 -20℃ 下長期保存。

( 6 ) 尼龍膜在 65°C 下先放入雜交液中預雜交 2~5 h , 雜交時要保持緩慢的搖動。50 ml 雜交液中含有 2 ml 5x HSB、1 ml Denhardt 反應液 II 和 1 ml 載體 DNA ( 在沸水中變性 7 min)。

( 7 ) 雜交使用的探針（長度大約為 500 bp) 可以通過對轉化用質粒進行酶切凝膠回收（用 QIAquick Gel Extraction  kit 試劑盒）后獲得，也可以通過 PCR 擴增后再用 PCR 回收試劑盒（ 即 QIAquickPCR  Purification  kit) 回收后獲得，具體操作根據產品的使用說明。25 ng ( 體積 15 μl) 的探針沸水浴 7 min 后在冰上放置 5 min，然后加入 5 μl OLB、2 μl BSA、2 μl DNA Polymerase I  Klenow 片段（5 U/μl) 和 2 μl 32P dCTP 在 37℃ 下反應 2 h 以完成探針的標記。標記好的探針用 2.6 μl 3 mol/L NaOH 變性 5 min，然后加入到預雜交液中。雜交膜在預雜交液中 65℃ 緩慢振蕩過夜。

( 8 ) 尼龍膜先用 500 ml 2x SSC 和 1% SDS 溶液洗兩次，每次 15 min，然后再用 500 ml 0.2 X SSC 和 1% SDS 溶液洗兩次，每次也是 15 min。洗好后，尼龍膜用薄膜包好。

( 9 ) 估測轉基因插入的位點數：處理好的尼龍膜可以用膠片放射自顯影分析或者磷屏分析。例如，在事例 2 中通過比較 T0和 T1 代植株的 Southern 分析結果可以得出轉基因插入位點為兩個（圖 13.3 ) 。 盡管 Southern 分析方法可以精確地鑒定出轉基因插入位點的數目，但是也有其局限性，具體請見注6 。此外，這種分析方法也可以用來檢測后代中轉基因位點結構的穩定性。當多個 DNA 片段或者載體一起轉化時，Southern 分析也應該用可以公用的單個探針或者多個特異性的探針混合在一起進行雜交（即每個片段或載體一個探針）。

二、每個轉基因插入位點的構型

當只有一個外源基因插入位點時，通過對 T。代植株的分子鑒定即可以了解插入位點外源基因的拷貝數和排列方式。當發現轉基因植株中有多個插入位點時（ 根據 3.1節中的方法鑒定），則要對每個插入位點逐個進行分析，其主要是采用分析分離群體的單株，或者分析各個位點的純合系的方法。

1. Southern 分析

在鑒定轉基因插入位點的構型時，Southern 分析是最常用的方法。通過酶切和能覆蓋用于轉化的全長 DNA 序列 （包括載體的骨架序列）的探針的聯合分析，可以重構出每個插入位點的全部結構。首先要做的是估測每個插入位點的外源基因拷貝數（保持原樣或者重排）。根據插入位點的復雜性采用不同的方法進行分析。下面分別介紹含有一個或少數幾個的拷貝數的簡單轉基因插入位點，以及含有大量拷貝數的復雜轉基因插入位點的具體分析方法。

( 1 ) DNA 的提取、膜的制備和雜交具體可以參考 3.1 節步驟 1~ 8。植物基因組 DNA  —般采用單酶切，本例中用的是質粒中的 Xbal 酶切位點。使用的探針必須可以與酶切位點 5 ' ( 以潮霉素基因為例）或者 3 ' ( 以 β-葡萄糖醛酸酶基因為例）端的外源基因序列特異性雜交（見注 8) 。

( 2 ) 用放射自顯影儀或者感光成像儀對膜進行初步分析，根據所得的結果一般就可以對每個插入位點的復雜性進行初步的評估。

① 簡單插入位點的分析

經過酶切和探針雜交后，Southern 分析所得結果產生最多 4 條亮度相近的雜交條帶 ( 如事例 2 位點 1 和位點2) 。

a. 用于 Southern 分析（3.1 節步驟 1~8 ) 的限制性內切核酸酶（ 見注 9 ) 和探針可以參照表13. 4 的常用方法。通過 Southern 分析不僅可以對轉基因位點區域內的序列進行研究，也可以對兩邊近鄰序列進行分析。如果需要更為精確的結果，推薦最好還是用多種不同的酶和探針進行多次分析。例如，在事例 2 的位點1 中 （ 圖 13.4)，應該再用 Hind Ⅲ 作為限制性內切核酸酶酶切，該酶切位點位于 β- 葡萄糖醛酸酶基因表達區的側邊，用 β- 葡萄糖醛酸酶基因啟動子或終止子的序列作為探針進行雜交分析，因為在該插入位點上可能存在多拷貝和重排的外源基因。另外，利用與載體抗性基因序列特異性結合的探針還可以檢測轉基因個體中是否含有載體序列。

b. 事例 2 位點 1 的結構鑒定：經過 Xba I 和 HindⅢ 酶切及 β-葡萄糖醛酸酶基因探針雜交后，膜上出現的多個條帶說明該插入位點可能含有多拷貝的 β-葡萄糖醛酸酶基因，一個完整和一個可能缺失的。但是，潮霉素基因和 NPTI 基因探針的雜交條帶卻只有一條，這個結果表明載體序列已經轉染和整合到了植物基因組上。這主要是因為 T-DNA 的左邊界的無效識別/剪切，導致對 T-DNA 序列的 “通讀”引起的（見注 10)。根據雜交條帶的大小，則可以推測出插入位點序列形成的結構（圖 13.4)。

c. 事例 2 位點 2 的結構鑒定：用 β- 葡萄糖醛酸酶基因和潮霉素基因的探針進行雜交時只有一條帶。用的探針雜交時沒有信號，表明載體主骨架沒有整合到植物基因組上。根據雜交條帶的大小可以推測出該位點序列所形成的結構（圖 13.5)。

② 復雜插入位點的分析

通過多種不同的限制性內切核酸酶和探針對事例 1 進行 Southern 分析，發現雜交結果中有 4 條或以上信號強度不同的雜交帶（圖 13. 6) 。對于這種情況，雜交結果一般不太可靠 [ 17 ] , 單獨的結果也不能用來精確地推測插入位點的構型和外源基因的拷貝數 ( 見注 11)。但是通過對雜交信號的光密度分析，還是可以估測轉基因以及外源基因完整的表達單位（即啟動子+基因+終止子）的拷貝數。用轉基因載體上所沒有的酶切位點進行 Southern 分析時，通過所得的結果也可以幫助了解插入位點處植物基因組序列的存在情況。

( a ) DNA 的提取可以參考3. 1 節步驟 1。必須先精確測定野生型植物基因組 DNA 濃度和作為標樣的質粒 DNA 濃度，以便于后續的光密度分析（見注 12)。

( b ) DNA 的消化可以參考3.1 步驟 2 。與 1 、 2 、5 、10、 20 、40 和 80 拷貝外源基因相當的標樣分別加入 5 μg 野生型 DNA 中 （ 見注 13 ) , 另外推薦在每張膜上加入陽性對照 （ 見注 14)。

( c ) Southern 分析主要參考3. 1 節步驟 3~8，利用 β- 葡萄糖醛酸酶基因表達區相鄰的 Hind Ⅲ 酶切位點，或者是 Pac I 、Nhe I 、Bst X I 、Apa I 和 Kpn I 等轉化載體上無酶切位點的酶，降解植物基因組 DNA。分析時需要4 種不同的探針：1 個單拷貝的 RFLP 探針；3 個分別可以與 β- 葡萄糖醛酸酶基因、潮霉素基因和 NPTI 基因特異性結合的探針。RFLP 探針是為了保證各個樣品所加樣量的均一性（見注 14)。經過 Hind Ⅲ 酶切后的雜交，一 些條帶的大小和質粒 DNA 酶切產生的（CfAS) 的表達區（2.9 kb) 相似，而其他的更大或小一些的條帶可能是由 DNA 重排所致。利用 Spe I 和 HPT 基因探針的 Southern 分析的結果與上面類似（ 圖 13.6) 。而利用載體無酶切位點的 Apa l 進行酶切時，β- 葡萄糖醛酸酶基因探針雜交出了兩條帶，由此表明該插入位點內可能還含有部分植物基因組序列。事例 1 中存在著大量拷貝的 NPT I 基因，也證實了載體序列的整入( 因為基因槍法使用的是完整的載體質粒）。然而根據這些信息仍然無法得出事例 1 中轉基因插入位點的構型。

( d ) 事例 1 中轉基因拷貝數的鑒定：雜交膜上除去背景后所有雜交信號的強度都可以用光密度計（Bio-Rad  690 ) 或感光成像儀等儀器進行定量分析。根據信號的強度和基因拷貝數的相關性，通過回歸分析可以重建標準曲線。依照標準曲線和酶-探針聯合分析的結果，則可以推測出每個樣品外源基因的拷貝數（ 見注 15 ) 。Hind Ⅲ、Spe l 和 Xba I 酶切后雜交的信號表明轉基因事例 1 中含有 36 個拷貝的 β- 葡萄糖醛酸酶基因和 14 個拷貝的潮霉素基因（圖 13. 6 ) 。

2. 其他方法

通過 Southern 雜交分析，對每個轉基因插入位點的總體結構有了一個大致的了解。但是要想完全掌握轉基因插入位點的所有信息，則需要對插入區和近鄰的基因組序列進行測序分析 [18, 19 ] ，有時對基因組 DNA 的序列分析更為重要。本章中，對此方法不做詳細介紹，但是，擬南芥 [ 20 ,  2 1 ] 和 水 稻 [ 22 ] 等模式植物的轉基因近鄰序列高通量分析方法已見諸報道。根據插入區近鄰植物基因組序列的測序結果，可以設計 PCR 引物，逐步地對整個插入區進行擴增和測序。此外，依照近鄰序列所設計的引物，還可以用于野生型基因組序列的擴增分析，從而可以鑒定出外源基因插入位點處是否存在基因組序列的丟失。同時，DNA 測序還能鑒定出轉基因時是否發生了葉綠體 DNA 和外源基因的共整合。