siRNA的轉染方法

將制備好的siRNA，siRNA表達載體或表達框架轉導至真核細胞 中的方法主要有以下幾種：

1.磷酸鈣共沉淀

將氯化鈣，RNA(或DNA )和磷酸緩沖液混合，沉淀形成包含DNA 且極小的不溶的磷酸鈣顆粒。磷酸鈣-DNA 復合物粘附到細胞 膜并通過胞飲進入目的細胞 的細胞 質。沉淀物的大小和質量對于磷酸鈣轉染的成功至關重要。在實驗中使用的每種試劑都必須小心校準，保證質量，因為甚至偏離最優條件十分之一個pH都會導致磷酸鈣轉染的失敗。

2.電穿孔法

電穿孔通過將細胞 暴露在短暫的高場強電脈沖中轉導分子。將細胞 懸浮液置于電場中會誘導沿細胞 膜的電壓差異，據認為這種電壓差異會導致細胞 膜暫時穿孔。電脈沖和場強的優化對于成功的轉染非常重要，因為過高的場強和過長的電脈沖時間會不可逆地傷害細胞 膜而裂解細胞 。一般，成功的電穿孔過程都伴隨高水平（50%或更高）的毒性。

3.DEAE-葡聚糖和polybrene

帶正電的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚體復合物和帶負電的DNA 分子使得DNA 可以結合在細胞 表面。通過使用DMSO或甘油獲得的滲透休克將DNA 復合體導入。兩種試劑都已成功用于轉染。DEAE-葡聚糖僅限于瞬時轉染。

4.機械法

轉染技術也包括使用機械的方法，比如顯微注射和基因槍（biolistic particle）。顯微注射使用一根細針頭將DNA ，RNA或蛋白直接轉入細胞 質或細胞 核。基因槍使用高壓microprojectile將大分子導入細胞 。

5.陽離子脂質體試劑

在優化條件下將陽離子脂質體試劑加入水中時，其可以形成微小的（平均大小約100-400nm）單層脂質體。這些脂質體帶正電，可以靠靜電作用結合到DNA 的磷酸骨架上以及帶負電的細胞 膜表面。因此使用陽離子脂質體轉染的原理與以前利用中性脂質體轉染的原理不同。使用陽離子脂質體試劑，DNA 并沒有預先包埋在脂質體中，而是帶負電的DNA 自動結合到帶正電的脂質體上，形成DNA -陽離子脂質體復合物。據稱，一個約5kb的質粒會結合2-4個脂質體。被俘獲的DNA 就會被導入培養的細胞 。現存對DNA 轉導原理的證據來源于內吞體和溶酶體。

為了達到高的轉染效率，在轉染實驗過程中，需要注意以下幾點：

1.純化siRNA

在轉染前要確認siRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNA，推薦用玻璃纖維結合，洗脫或通過15-20%丙烯酰胺膠除去反應中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和鹽離子。注意：化學合成的RNA通常需要跑膠電泳純化（即PAGE膠純化）。

2.避免RNA酶污染

微量的RNA酶將導致siRNA實驗失敗。由于實驗環境中RNA酶普遍存在，如皮膚，頭發，所有徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品等，此保證實驗每個步驟不受RNA酶污染非常重要。

3.健康的 細胞 培養">細胞 培養物和嚴格的操作確保轉染的重復性

通常，健康的細胞 轉染效率較高。此外，較低的傳代數能確保每次實驗所用細胞 的穩定性。為了優化實驗，推薦用50代以下的轉染細胞 ，否則細胞 轉染效率會隨時間明顯下降。

4.避免使用抗生素

Ambion公司推薦從細胞 種植到轉染后72小時期間避免使用抗生素。抗生素會在穿透的細胞 中積累毒素。有些細胞 和轉染試劑在siRNA轉染時需要無血清的條件。這種情況下，可同時用正常培養基和無血清培養基做對比實驗，以得到最佳轉染效果。

5.選擇合適的轉染試劑

針對siRNA制備方法以及靶細胞 類型的不同，選擇好的轉染試劑和優化的操作對siRNA實驗的成功至關重要。

6.通過合適的陽性對照優化轉染和檢測條件

對大多數細胞 ，看家基因是較好的陽性對照。將不同濃度的陽性對照的siRNA轉入靶細胞 （同樣適合實驗靶siRNA），轉染48小時后統計對照蛋白或mRNA相對于未轉染細胞 的降低水平。過多的siRNA將導致細胞 毒性以至死亡。

7.通過標記siRNA來優化實驗

熒光標記的siRNA能用來分析siRNA穩定性和轉染效率。標記的siRNA還可用作siRNA胞內定位及雙標記實驗（配合標記抗體）來追蹤轉染過程中導入了siRNA的細胞 ，將轉染與靶蛋白表達的下調結合起來。