真核細胞總RNA的分離提取

RNA是基因表達產物，由以下幾類分子組成，rRNA（占細胞總RNA的80%～85%）、tRNA和核內小分子RNA（占10～15%）、mRNA（占1～5%）。其中mRNA是分子生物學的主要研究對象，分離制備mRNA是克隆基因，分析基因表達以及建立cDNA文庫的首要步驟。
真核細胞總RNA分離提取的目的是要獲得高純度的具有充分長度的RNA分子，包括RNA的純度和完整性。RNA分離的關鍵是盡量減少RNA酶的污染。RNA酶活性非常穩定，分布廣泛，除細胞內源性的RNA酶外，環境中也存在RNA酶。因此在提取RNA時，應盡量創造一個無RNA酶的環境，包括去除外源性RNA酶的污染和抑制內源性RNA酶活性。主要是采用RNA酶的阻抑蛋白RNasin和強力的蛋白質變性劑鹽酸胍或異硫氰酸胍抑制內源性RNA酶，采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶。
一、RNA提取 的關鍵
真核細胞RNA的提取過程有四個關鍵點，即①樣品（細胞或組織）的有效破碎；②有效地使核蛋白復合體變性；③對內源RNA酶的有效抑制；④有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離；其中最關鍵的是抑制ＲＮＡ酶活性。提取的RNA可以用于核酸雜交、cDNA合成以及體外翻譯等。
二、組織RNA提取的基本步驟
1.儀器：勻漿器、低溫離心機、離心管。

2.試劑：氯仿、75%乙醇、異丙醇、DEPC溶液、1%甲醛變性膠、37%甲醛、3%過氧化氫、甲酰胺、RNA上樣緩沖液。
3.主要步驟
（1）取組織50~100mg，加0.8ml Trizol沖洗勻漿器，移入同一離心管，冰上靜置5min。
（2）加0.2ml氯仿，充分震蕩混勻，靜置3min，4℃，12000g×15min離心。棄沉淀。
（3）取上清，加入0.5ml異丙醇，顛倒混勻。－20℃靜置2h，4℃，12000g×10min離心。
（4）棄上清，取沉淀，加入1ml 75%乙醇溶液，漂洗沉淀，4℃，7500g×5min離心。
（5）棄上清，沉淀真空干燥10min。
（6）加40μl DEPC溶液，充分溶解RNA。
4.結果鑒定
（1）紫外分光光度計檢測：取RNA溶解液，按一定比例稀釋后，紫外分光光度計測定260nm、280nmOD值，計算OD260/OD280比值，如果比值在1.7~2.0：1之間，說明RNA純度可。
標準樣品當OD260＝1時，RNA濃度約為40μg/ml，根據下述公式計算RNA濃度：RNA濃度（μg/ml）＝OD260×稀釋倍數×40。

（2）電泳檢測：1%甲醛變性膠電泳觀察RNA質量，電泳槽及制膠板先用3%過氧化氫浸泡過夜；制1%甲醛變性凝膠板：4.5μl RNA，2ul 5×甲醛膠電泳緩沖液，3.5μl 37%甲醛，10ul甲酰胺，離心混勻，65℃變性15min后，迅速置冰浴中；再加入2μl RNA上樣緩沖液，離心混勻后上樣，6V/cm電壓，電泳1～2h；暗室內紫外光下觀察，拍照；如果觀察到清晰的18S、28S RNA電泳帶，無大量小分子RNA，說明RNA無明顯降解，樣品－70℃保存備用。
三、注意事項
1、所有玻璃器皿160～180℃高溫干烤6h以上，非耐高溫器皿經0.1% DEPC液浸泡后，經高溫（15磅，20min）處理滅活RNA酶，所用試劑均用DEPC水配制，然后高壓處理。
2、實驗用水要經DEPC處理，但含Tris的試劑不能用DEPC處理。
3、實驗操作過程中要戴一次性手套，以避免RNA酶污染。