葡聚糖凝膠層析（分子排阻層析或凝膠過濾）

【實驗目的】
1.掌握葡聚糖凝膠的特性及凝膠層析的原理。
2．學習葡聚糖凝膠層析的基本操作技術。

【實驗原理】
凝膠層析又稱分子排阻層析或凝膠過濾，是以被分離物質的分子量差異為基礎的一種層析分離技術，這一技術為純化蛋白質等生物大分子提供了一種非常溫和的分離方法。層析的固定相載體是凝膠顆粒，目前應用較廣的是：具有各種孔徑范圍的葡聚糖凝膠（Sephadex）和瓊脂糖凝膠（Sepharose）。
葡聚糖凝膠是由直鏈的葡聚糖分子和交聯劑3—氯1，2—環氧丙烷交聯而成的具有多孔網狀結構的高分子化合物。凝膠顆粒中網孔的大小可通過調節葡聚糖和交聯劑的比例來控制，交聯度越大，網孔結構越緊密；交聯度越小，網孔結構就越疏松，網孔的大小決定了被分離物質能夠自由出入凝膠內部的分子量范圍。可分離的分子量范圍從幾百到幾十萬不等。
葡聚糖凝膠層析，是使待分離物質通過葡聚糖凝膠層析柱，各個組分由于分子量不相同，在凝膠柱上受到的阻滯作用不同，而在層析柱中以不同的速度移動。分子量大于允許進入凝膠網孔范圍的物質完全被凝膠排阻，不能進入凝膠顆粒內部，阻滯作用小，隨著溶劑在凝膠顆粒之間流動，因此流程短，而先流出層析柱；分子量小的物質可完全進入凝膠顆粒的網孔內，阻滯作用大，流程延長，而最后從層析柱中流出。若被分離物的分子量介于完全排阻和完全進入網孔物質的分子量之間，則在兩者之間從柱中流出，由此就可以達到分離目的。
本實驗以葡聚糖凝膠G—25作為固定相載體，來分離藍色葡聚糖—2000和溴酚藍。藍色葡聚糖— 2000分子量接近2×106， 而溴酚藍分子量為670，二者分子量相差較大，前者完全排阻，而后者則可完全進入凝膠顆粒網孔內，二者通過層析柱的時間不同而分開。

【實驗材料】
1.實驗器材
層析柱(1×20cm)附有一小段乳膠管及螺旋夾；洗脫液瓶(帶下口的三角瓶，250m1)；試管及試管架；量筒10m1；721型分光光度計
易生物儀器庫：http://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html
易生物試劑庫：http://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html
2.實驗試劑
(1) Tris—醋酸緩沖液 (pH7.0):取0.0lmol/L Tris溶液(含0.1mol/L KCl)900ml，用濃醋酸調pH至7.0，加蒸餾水至1000m1。
(2) 溴酚藍溶液：稱取溴酚藍10毫克，溶于5毫升乙醇中，充分攪拌使其溶解，然后逐滴加入Tris—醋酸緩沖液(pH7.0)至溶液呈深藍色。
(3) 藍色葡聚糖—2000溶液：稱取藍色葡聚糖—2000 10毫克，溶于2毫升Tris—醋酸緩沖液(pH7.0)中即成。
(4) 樣品溶液：取溴酚藍溶液0.1毫升，藍色葡聚糖—2000溶液0.5毫升混勻后為上柱樣品溶液。
(5)葡聚糖凝膠G- 25 (Sephadex-G-25)

【實驗操作】
1.實驗凝膠的制備：商品凝膠是干燥的顆粒，使用時需經溶脹處理，稱取4克葡聚糖凝膠G—25，加50毫升蒸餾水，攪拌均勻，在室溫溶脹6小時，或沸水浴溶脹 2小時，一般采用后一種方法。再用傾瀉法除去凝膠上層水及細小顆粒，用蒸餾水反復洗滌幾次，再以緩沖溶液(pH7.0的Tris—醋酸溶液)洗滌2—3次，使pH和離子強度達到平衡，最后抽去溶液及凝膠顆粒內部氣泡，凝膠可保存在緩沖液內。
2.裝柱：將層析柱洗凈，垂直固定在鐵支架上，選擇有薄膜端作為層析柱下口，將下口接上乳膠管并用螺旋夾夾緊。層析柱中加入洗脫液，打開下口螺旋夾，讓溶液流出，排除殘留氣泡，最后保留約2厘米高度的洗脫液，擰緊螺旋夾。將凝膠輕輕攪動均勻，用玻璃棒沿層析柱內壁緩緩注入柱中，待凝膠沉積到柱床下已超過l厘米時，打開下口螺旋夾，繼續裝柱至柱床高度達到8厘米,關閉出口。裝柱過程中嚴禁產生氣泡，盡可能一次裝完，避免出現分層。再用洗脫液平衡l至2個柱床體積，凝膠面上始終保持有一定的洗脫液。平衡后，擰緊下端螺旋夾。
3.加樣品：打開螺旋夾使柱面上的洗脫液流出，直至床面與液面剛好平齊為止，關閉下端出口。取溴酚藍及藍色葡聚糖—2000混合液0.3毫升，小心地加于凝膠表面上，切勿攪動層析柱床表面。打開下端出口，使樣品溶液進入凝膠內，并開始收集流出液。當樣品溶液恰好流至與凝膠表面平齊時，關閉下端出口。用少量洗脫液清洗層析柱加樣區，共洗滌三次，每次清洗液應完全進入凝膠柱內后，再進行下一次洗滌。最后在凝膠表面上加入洗脫液，保持高度為3—4cm。
4.洗脫與收集：連接好凝膠柱層析系統，調節洗脫液流速為每分鐘1毫升，進行洗脫。仔細觀察樣品在層析柱內的分離現象，收集洗脫液，每收集3毫升即換一支收集管 (試管預先編號)，收集約20管左右，樣品即可完全被洗脫下來。將各收集管中的洗脫液分別用721型分光光度計在波長540nm處測定其光密度。
5. 凝膠回收處理方法：將樣品完全洗脫下來后，繼續用三倍柱床體積的洗脫液沖洗凝膠后，將柱下口放在小燒杯中，慢慢打開，再將上口慢慢松開，使凝膠全部回收至小燒杯中，備用。

【實驗結果】
以洗脫管號為橫坐標，以光密度為縱坐標作圖即得洗脫曲線。分析曲線圖并討論實驗結果。