細胞凋亡的免疫檢測技術1

一、概述

細胞凋亡（apoptosis,Apo）是細胞增殖的反面，探討的是細胞死亡的方式與機制。凋亡一詞來源于希臘語。原指花瓣、葉片的脫落。自1972年Kerr首次提出細胞凋亡的概念以來，隨著細胞生物學、免疫學和腫瘤學的研究發展，最近幾年人們對細胞凋亡的重大理論意義和實際意義有了更深的理解。細胞凋亡是指在一定的生理和病理情況下，機體為維護內環境的穩定，通過基因調控而使細胞自動消亡的過程。不同類型的細胞，在發生凋亡時的動力學過程也不一致，存在著一定的形態學和生物化學的差異，但若干基本變化是大同小異的。其特征為：整個胞體呈濃縮狀，有特異性胞漿大泡，胞質、核質深染，核碎裂后被細胞膜包裹而形成凋亡小體（apoptosis body）。它有別于細胞死亡（necrosis,Nec）。在瓊脂糖凝膠電泳上顯示出特殊的DNA梯狀圖譜。它的出現主要是由于一種鈣-鎂依賴性核酸內切酶激活后，裂解染色質核小體（nucleosome）之間的連接DNA，將核小體切割成 180bp～200bp或其倍數的片段所致。Apo是不可逆的過程，散在分布于組織中，形成的凋亡小體，除核裂解外，外有膜包繞，內有完整的細胞器，凋亡小體在組織中很快被鄰近組織細胞吞噬，并在溶酶體中被降解。因此，Apo不引起周圍組織炎癥及損傷。Apo是機體自己啟動，由細胞本身主動控制，由基因指導的細胞自我消亡過程。因此，又稱程序性細胞死亡（programmed cell death,PCD）。
光鏡下，Apo的典型形態學特征是核染色質廣泛凝聚，細胞體積縮小，胞質濃縮，有凋亡小體存在，細胞表面特化結構如微絨毛等丟失及細胞表面明顯的迂曲。體內細胞凋亡過程發展非常迅速，細胞常在數小時內完成Apo并降解，凋亡細胞僅出現數分鐘就消失，故不適宜應用形態學方法（普通光學顯微鏡檢測法、熒光顯微鏡檢測法、凋亡小體的電鏡觀察及凋亡指數和細胞活力的定量測定）來檢測。在生物化學方面，利用電泳技術證明核體斷片的“DNA梯狀圖譜”作為檢測群體細胞發生凋亡的一個指標。經過人們多年的研究發現，應用原位末端轉移酶標記技術（TDT assay or TUNEL reaction）來檢測細胞凋亡，其靈敏度高，特異性強，能早期顯示未發生典型變化的凋亡細胞。它是檢測單個細胞早期出現凋亡現象的好方法。近幾年，人們又發現了能更快、更敏感、檢測細胞數量更多的并能從更多方面證明凋亡和壞死的流式細胞分析術（flow cytometry，FCM 包括亞“G1”峰檢測法和末端轉移酶標記技術）等。本章僅介紹免疫學檢測方法。

二、ELISA法

（一） 原理
細胞凋亡的發生，是由于鈣-鎂依賴性核酸酶進入核小體間切割DNA,產生180bp～200bp或其倍數的核小體片段。而核小體由于與組蛋白 H2A、H2B、H3和H4形成緊密復合物而不被核酸內切酶切割。采用雙抗體夾心酶免疫法，應用小鼠抗DNA和抗組蛋白的單克隆抗體，與核小體片段形成夾心結構，可特異性檢測細胞溶解物中的核小體片段。
（二）材料與試劑
1．采用 Boehringer Mannheim公司試劑盒，生物標記的小鼠抗組蛋白單克隆抗
體。
2．過氧化物酶（-POD）標記的小鼠抗DNA單克隆抗體
3．鏈霉親合素包被的微孔板
4．DNA－組蛋白復合物，作為陰性對照。
5．ABTS底物
6．溶解緩沖液
7．溫育緩沖液
8．底物緩沖液
（三）樣品
1．培養細胞或離體細胞的裂解物 細胞裂解步驟：收集細胞，離心后，用200μl溶細胞緩沖液重新懸浮，室溫下作用30min。
2．培養細胞的上清液
3．血漿（血清）
（四）操作方法

1．取樣品離心后（1 000r/min,10min）,吸取20μl上清液，加入鏈霉親合素包被的培養板孔中。
2．另加入80μl免疫反應試劑 含抗－DNA－POD、抗組蛋白－生物素及溫育緩沖液（按1︰1︰18混合），室溫下孵育2h（置搖床上，250r/min）。
3．取上清，用300μl溫育緩沖液洗滌3次，小心移去洗滌液。
4．加入100μl底物緩沖液，室溫下孵育使顏色變化至適合（置搖床上）。
5．盡快作比色分析（10min～20min內），用底物緩沖液作空白對照，以波長405nm，參考波長 492nm進行檢測。

（五）結果判定

按下列公式計算細胞釋放的單/低聚核小體片段的特別聚集值：

注：mU= 吸收值（10-3）=雙孔吸收值的平均OD值－底物OD值，若樣品的吸
收值超過比色測定范圍，應適當稀釋后再檢測。
三、原位末端轉移酶標記技術

（一）原理
凋亡細胞是由于內源性核酸內切酶的激活后，將DNA切割成許多雙鏈DNA片段以及高分子量DNA單鏈斷裂點（缺口），暴露出大量3-羥基末端，如用末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）將標記的dUTP進行缺口末端標記，則可原位特異地顯示出凋亡細胞。主要應用的是熒光標記法和酶標記法。