通過模擬細菌DNA實現穿越其限制修飾屏障的新方法

        細菌是存在于自然環境中的一個重要生物類群，參與自然環境碳、氮和硫等元素的循環，另外，細菌在人類的健康與疾病、工業微生物發酵及農業生物病蟲害防治等領域也占有重要地位。遺傳操作是研究細菌生理功能、致病機理及構建基因工程菌株的先決條件。迄今為止，僅有少數實驗室的模式菌株實現了遺傳轉化，而對直接從自然環境中分離的野生型細菌、經人工馴化的工業生產菌及大量的非模式菌株實現遺傳操作始終是困擾微生物學家的一個世界性難題。限制修飾（Restriction modification, RM）系統是外源DNA進入細菌并實現穩定遺傳的主要屏障。在完成基因組測序的所有細菌中，95%的菌株含有RM系統，而33%的菌株更是含有四套以上RM系統，含有多套RM系統使細菌的遺傳操作更加困難。

　　典型的RM系統由DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferases, MTase）和限制性內切酶（Restriction endonucleases, REase）構成。REase可特異性識別進入細菌內部的外源DNA并對其切割、降解，而MTase可通過甲基化修飾細菌自身的DNA而使其與外源DNA區別開來，不被REase降解。

　　中國科學院微生物研究所溫廷益研究組的張國強博士建立了在大腸桿菌中模擬靶細菌DNA甲基化模式（Mimicking of DNA methylation patterns, MoDMP）、穿越靶細菌限制屏障、實現含有多套RM系統的細菌遺傳操作的新方法。在一株內源限制修飾系統全部缺失的大腸桿菌EC135中，研究人員克隆表達了來自漢氏硝化細菌（Nitrobacter hamburgensis）X14（研究細菌硝化作用的模式菌株，盡管已有100多年的純培養歷史，因含有11套RM系統而難以進行遺傳轉化）、蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）ATCC 10987（含有與炭疽芽胞桿菌中編碼炭疽毒素合成蛋白類似的大質粒，是研究炭疽病的理想的非致死菌株，由于含有9套推定的RM系統而導致來自于大腸桿菌的質粒轉化效率極低，難以實現遺傳操作）和解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）TA208（鳥嘌呤核苷工業生產菌，因含有5個推定的MTase而難以利用傳統方法實現基因敲除）的24個推定MTase，經活性驗證后，將13個具有活性的MTase通過釀酒酵母一步組裝法分別組裝至3個質粒共表達。驗證結果表明共表達了MTase的大腸桿菌具有與難轉化細菌相似的DNA甲基化模式。

　　利用MoMDP系統，研究人員首次成功實現了硝化細菌X14的遺傳轉化和綠色熒光蛋白表達，首次實現了在鳥苷工業生產菌中利用整合質粒進行基因敲除，另外，穿梭質粒對兩株芽胞桿菌的轉化效率也有了大幅提高，最高達到104倍。最終，通過實驗證據，研究人員提出并驗證了通過模擬頑固細菌DNA甲基化模式實現穿越其限制修飾屏障的理論模型。

　　MoDMP系統在兩株革蘭氏陽性的異養細菌和一株革蘭氏陰性的化能自養細菌中均得到了成功應用，在不同種屬細菌中的適用性表明，MoDMP系統可被應用于其它已知全基因組序列的、尚不能進行遺傳轉化的細菌的遺傳操作。該方法為研究具有重要生理意義和致病性細菌的生理功能、為改造具有重要應用價值的工業微生物提供了新方法和新思路。

　　相關研究結果已發表于遺傳學期刊PLoS Genetics上。