流式細胞術在CART治療中的應用

過去十年，CAR-T治療進展迅速，有阻礙，也有進步。

CAR-T治療效果要得到保障，流式細胞術少不了。流式在CAR T細胞療法中有多種關鍵性的應用：

1、在整個生產過程中監控CAR T細胞群體組成，并評估體內細胞的持久性和治療效果

在CAR T制造的前期階段，流式細胞術可用于分析單采血液分離產品的成分，并確定與預后更好或更差相關的供體T細胞的特定群體。例如，CD27 + CD45RO-CD8 + T細胞的比例增高，與抗CD19 CAR T細胞治療CLL患者的持續緩解有關，如果這類細胞少或缺失，則與治療失敗有關（Fraietta et al，2018）。類似地，BCMA特異性CAR T細胞如果CD8 + CD45RO ? CD27 +亞群比例高，則在多發性骨髓瘤患者中治療效果越好（Cohen et al，2019）。

在另一項研究中，B-ALL兒童患者血液中分離出的初代T細胞中，如果LAG-3 + / TNF-alpha-low CD8 +亞群多，則這類患者就容易發生抗CD19 CAR T治療失敗（Finney et al，2019）。

這些研究表明，盡管需要分析的T細胞表型可能在不同疾病和不同治療方法之間有所不同，但是對單采細胞中T淋巴細胞的表型分析，可以為CART細胞的生產以及進一步的患者管理提供預后評估的指標。

流式細胞術還可用于評估輸注之前CAR T細胞的表型和功能。抗CD19治療CLL后表現出完全應答的患者，其CAR T細胞可產生更高水平的STAT3相關細胞因子（包括IL-6、IL-17、IL-22、IL-31、CCL20），并且血清IL-6水平與CAR T細胞擴增相關。表達高水平的IL-6受體的CD27 + PD-1 ? CD8 + CAR T細胞可預測治療反應的改善（Fraietta et al，2018）。在CAR-T治療有效的小鼠白血病模型，如果去除CAR T產物中CD27 + PD-1-CD8 + T細胞群，則會導致白血病復發（Fraietta et al，2018）。相反，某些標志物的存在預示著治療失敗，例如：CD8 + PD-1 +表型的CAR T細胞百分率高則預示治療失敗，PD-1和LAG-3的共表達或TIM-3表達與預后差相關（Finney et al，2019; Fraiettaet al，2018）。采用流式細胞術算法來確定可預測患者對免疫療法反應的CAR T細胞生物標志物，從而可以幫助建立預后模型，并最終導致更個性化的治療方法（Aghaeepour et al，2012；Bruggner，Bodenmiller，Dill，Tibshirani, Nolan，2014；Pouyan & Nourani，2017）。

輸注后，流式細胞術成為監測CAR-T細胞擴增和持久性、評估治療反應的必要工具。例如，在抗CD19 CAR T細胞用于治療兒童和成人復發性和難治性 B-ALL的臨床試驗中，流式細胞儀用于量化CAR T細胞擴增的程度，并檢測是否存在對治療有反應的患者的骨髓和腦脊液中的CAR T細胞（Grupp et al，2013; Maude et al，2014）。治療后，需用流式細胞術對這些患者進行了縱向隨訪，明確獲得持續緩解的患者中MRD陰性，并及時發現復發的患者。在復發的情況下，流式細胞術還有助于確定白血病細胞的數量和表型，例如在一名兒童B-ALL復發的情況下，流式可發現患兒的原始細胞出現CD19抗原的丟失（Grupp et al，2013年）。

在輸注之前和之后，對CAR產品進行評估時，需要考慮的一個重要因素是要確保方案能夠鑒定出CAR陽性的白血病細胞。盡管非常罕見，但有報道稱在CAR T細胞生產過程中CAR也能轉染到白血病細胞上，從而與治療性CAR T細胞混在一起，最終導致復發。這種耐藥機制是在接受抗CD19 CAR T細胞后復發的B-ALL患者中發現的（Ruella et al，2018）。這凸顯了需要使用流式細胞術而不是僅僅依靠qPCR監測CAR T擴增的重要性，因為流式能夠使我們確定正在擴增的CAR陽性細胞是否存在非T細胞群體（白血病細胞）。

2、檢測CAR的表達

CAR表達的檢測蠻有挑戰。傳統上，使用針對CAR的細胞外部分的熒光抗體，流式細胞術能夠檢測CAR。山羊抗小鼠抗體已被用于鑒定用鼠scFv構建的CAR，但該方法不適用于使用人源化或完全人源抗體構建的抗原識別域的CAR，或基于非抗體的CAR。此外，許多多克隆抗體之間的變異可能導致結果不一致（Ascoli＆Aggeler，2018; Voskuil，2014）。

針對其同源CAR受體抗原結合結構域的抗獨特型單克隆抗體可以高度特異性地檢測CAR（Jena et al，2013）。但是，對于臨床流式細胞實驗室來說，一個重要的問題是，盡管存在抗獨特型抗體可用于檢測許多CAR T產品，但這類抗體并沒有商品化，這導致缺乏用于鑒定抗原特異性CAR的“金標準”，并使CAR檢測的標準化變得困難。有多種可用于檢測CAR表達的試劑和策略，但是這些試劑不是通用的，需要對每種CAR T產品類型進行驗證。Jozwik等人在2020年發表了一個流式細胞術方案，可檢測“通用”同種異體CAR T細胞，其中CAR來源于抗人CD19鼠單克隆抗體的scFv，并且剔除了TRAC和CD52基因。

基于抗體的流式細胞術固有的一個問題是抗體與白細胞和死細胞的非特異性結合，產生背景熒光。添加死細胞排除染料（例如7AAD）有助于識別死細胞，從而避免死細胞導致的非特異性結合影響結果。由于CAR T細胞通常很大且被活化，因此它們的前向散射光與側向散射光（FSC / SSC）在某種程度上可以與單核細胞重疊，所以有必要包含單核細胞標記物（例如CD14）排除單核細胞干擾。IgG1和IgG2a與單核細胞上表達的Fc受體的非特異性結合可以通過使用商品化Fc阻斷劑、小鼠或人血清或高濃度的小鼠或人IgG阻斷。但是，對于基于modular Fc的CAR T細胞，Fc受體阻斷可能掩蓋CAR分子的抗原識別域，因此必須使用對CAR結果中的非抗原結合部分具有特異性的檢測分子來實現其鑒定。

基于蛋白質L的檢測方法可檢測基于抗體的CAR，而不會涉及其抗原結合位點（Zheng，Chinnasamy，＆Morgan，2012）。蛋白質L是一種細菌的表面蛋白質，從大腸擬肽鏈球菌中分離出來。它選擇性地結合免疫球蛋白和Fab片段的κ輕鏈，但不結合它們的Fc部分。它具有識別單鏈抗體片段的能力，使其成為檢測細胞表面CAR表達的便捷試劑。用生物素標記的蛋白L標記淋巴細胞，然后用PE偶聯的鏈霉親和素進行染色，可以高度特異性地檢測源自鼠和人scFv的CAR，其結果與使用山羊抗小鼠抗體或抗原 Fc /山羊抗人IgG一致（Zheng等，2012）。該方法的缺點是它也會標記κ陽性的B細胞，因此需要多標記一個CD3，以將CD3 + CAR + T細胞與已被CAR構建體轉導的B細胞區分開。

檢測CAR還有一個很好的方法是利用熒光染料標記的對應抗原。基于可溶性抗原的檢測方法不僅可以評估CAR在細胞表面的表達，還可以證實CAR能夠與其同源抗原結合。例如，使用CD19sIg（一種由人CD19細胞外域和與 Alexa Fluor 488 人IgG1的Fc段組成的融合蛋白）通過流式細胞術可檢測低至0.5％的CAR T細胞，且背景染色最少。（De Oliveira et al，2013）。使用可溶性重組BCMA通過流式細胞術檢測CAR T細胞表面的抗BCMA CAR表達（Bu et al，2018）。現在有多種商品化熒光標記的或預生物素化的可溶性抗原，包括CD19、CD22、CD33、BCMA和EGFR等，用于CAR T細胞檢測。需要注意的是，CAR上面的配體結合表位不應被熒光染料“隱藏”或阻斷，以確保CAR與抗原的順利結合。

可溶性抗原系統的另一個例子是Topanga試劑，其中CAR抗原與一種最近發現的海洋螢光素酶融合，其亮度比常用螢火蟲螢光素酶高1,000倍（Gopalakrishnan et al，2019）。已證明該測定法可與由人CD19的各種表位構建的試劑一起使用，包括完整的CD19細胞外域、非CD19抗原和不同的海洋熒光素酶。結合抗原決定簇標簽后，Topanga試劑可被親和層析純化，并應用于流式細胞術確定表達CAR的細胞的百分比。使用Alexa Fluor 647標記的Topanga試劑通過單步流式細胞術獲得的結果與使用生物素化蛋白L的多步方法所獲得的結果一致性較好。此外，已證明未純化的標簽表位標記的Topanga試劑也可以用于流式細胞術檢測表達CAR的細胞，無需經過耗時且昂貴的蛋白質純化和標記步驟（Gopalakrishnan et al，2019），能夠在含有多達一百萬個外周血單個核細胞中檢測到10個表達CAR的細胞，由于沒有Fc受體、一步法和不需要二抗標記，所以非特異結合水平很低。

3、評估CAR T細胞的效應功能

近年來，已開發出許多不同的評估效應細胞毒性的方法（Adan，Kiraz &Baran，2016），包括

測定死細胞釋放放射性同位素或染料的方法（Brunner, Mauel, Cerottini, & Chapuis, 1968）

活細胞保留同位素或染料的方法（Neri, Mariani, Meneghetti, Cattini, & Facchini, 2001）

ATP含量檢測（Nowak，Kammerer &Kupper，2018）

活細胞的酶活性（Prabst，Engelhardt，Ringgeler & Hubner，1601）

測量死細胞釋放到上清液中的細胞內物質的水平（Fotakis ＆Timbrell，2006）

量化表達螢火蟲熒光素酶的靶細胞釋放發出的熒光（Brasier，Tate，＆Habener，1989; Mitsuki等，2016）

每種方法都有其優點和缺點，但是只有流式細胞儀才能檢測單細胞，并同時評估效應細胞及其靶標的多個參數（Martinez et al，2018; Mihara，Yoshida ，＆Bhattacharyya，1904）。

高通量流式細胞儀可同時量化CAR表達、分析CAR陽性細胞的活化、脫顆粒和耗竭狀態，以及區分CAR T細胞和靶細胞群（Martinez et al，2018; Mihara et al， 1904）。CAR T細胞活化的表現包括含有細胞毒蛋白的胞吐（例如穿孔素和顆粒酶）、脫顆粒功能分子的出現（例如CD107a）、存在活化標記（例如PD-1或CD25）、死亡信號分子的表達（例如Fas-L或TRAIL） ，并產生各種炎性細胞因子。有趣的是，單細胞細胞毒活性測定表明CD8 +和CD4 + CAR T細胞均具有細胞毒性（Xhangolli et al，2019），它們產生的炎性細胞因子由Th1和Th2譜系混合組成，包括IFN-γ、TNF-α、IL-5和IL-13。

流式細胞術的挑戰之一是評估實體瘤中的細胞毒殺傷作用。實體腫瘤細胞需要在通過超聲或酶消化進行分解才能制備單細胞懸液。酶消化（例如胰蛋白酶處理）可能會破壞表面蛋白，因此，雖然陽性結果很可能是真實的陽性結果，但由于存在假陰性可能，如果沒有也不應過度解讀為沒有用（Donnenberg，Corselli，Normolle，Meyer &Donnenberg，2018）。不過也不用太擔心，現在已開發出成功的方法來優化腫瘤細胞解離，而對細胞存活率或抗原表達的影響卻最小，這樣，通過高通量多參數流式細胞術，就能一次性同時檢測CAR T細胞功能以及針對實體瘤細胞系的細胞毒性（Martinez et al，2018）。

靶細胞和效應細胞結合是細胞介導的殺傷所固有的現象，但是這種結合造成的粘連，會極大地阻礙傳統流式細胞術進行細胞分析。解決此問題的一種方法是細胞核流式細胞術（Rabinovich et al。，2019）。

4、評估腫瘤抗原表達和免疫抑制分子

流式細胞術在細胞治療中的另一個重要應用是評估腫瘤抗原表達和評估TME。研究表明，足夠的抗原表達對于確保有效的CAR T細胞起作用是必要的。在一項試驗中，發現CD19陽性B-ALL的臨床緩解持久性與輸注時白血病細胞上CD19的表達水平相關，并且需要足夠高的抗原負荷才能觸發CAR T細胞增殖（ Finney et al，2019）。在另一項研究中，CD22陽性ALL中的抗原低表達與抗CD22 CAR T細胞的持久性減弱、體內和體外功能降低有關，并與CAR T細胞中初始表型增加有關（Ramakrishna et al，2019） 。增加CAR親和力并不能改善對低抗原性白血病的反應，但給予Bryostatin1（一種上調白血病細胞上CD22表達的治療藥物）可以改善CAR T細胞的功能和體內持久性（Ramakrishna et al，2019年）。

量化腫瘤靶抗原密度在兩種不同情況下可能有用。首先，可以將其用于輸注前的篩選，以定義表達CAR靶抗原的異常細胞的比例和在表面表達的分子數量。該信息可能很有價值，因為很難知道什么抗原密度閾值足以觸發通過CAR激活T細胞。其次，患者輸注CAR-T后，以定量的方式跟蹤靶抗原的表達水平可能有助于理解耐藥性。

TME是實體瘤對免疫療法產生臨床反應的重要中介。流式細胞術可以區分眾多腫瘤浸潤免疫細胞亞群，并評估免疫抑制標志物，例如IDO1、PD-L1、FoxP3、TDO、IL-10和TGF-beta，并進行腫瘤異質區域之間的對比研究。但是，它需要開發有效的方法來分離完整的腫瘤細胞、分離浸潤的免疫細胞，并以高通量的方式運行復雜的分析模板。最近有多篇文章提供了流式細胞術評估實體瘤中TME的詳細方案（Young，Bolt，Ahn，＆Mann，2016; Yu et al，2018）。