甲基化——腫瘤檢測治療的又一靶標？

在測序和相關技術不斷進步的今天，研究人員不僅能夠獲得DNA、RNA的堿基序列，更能夠獲得堿基修飾的復雜信息。目前已經證明DNA甲基化能夠導至的腫瘤產生，而Ribomed、基準醫療和鹍遠基因等公司作為該領域的先行者，已經開發出相關產品。RNA作為中心法則的下游分子，也有多種多樣的修飾，特別是m6A甲基化目前也愈發受到關注。今天，小編就和大家梳理一下甲基化修飾與檢測的來龍去脈。

一、什么是甲基化？

甲基化是指堿基上引入甲基的過程，DNA，RNA均存在甲基化現象。

DNA甲基化是指DNA序列上特定的堿基在DNA甲基轉移酶的催化作用下，使得堿基獲得甲基的過程。這種DNA甲基化修飾可以發生在胞嘧啶、腺嘌呤及鳥嘌呤。一般研究中所涉及的DNA甲基化主要是指CpG島上胞嘧啶的甲基化過程，其產物為5-甲基胞嘧啶（5mC）。CpG島（CpG island）是指基因組某些區域CpG序列的密度比平均密度高10~20倍，CpG島的功能是通過甲基化與去甲基化調控下游基因的表達。如果CpG島發生高甲基化，基因表達就會被抑制。腫瘤中普遍存在DNA甲基化狀態變化，一般是總體甲基化水平降低與局部甲基化水平升高，指示腫瘤相關蛋白的失控表達。因此針對相關DNA序列甲基化檢測可以幫助腫瘤的早期篩查。

圖1 DNA甲基化

RNA甲基化成因則更為復雜，m6A（N6-methyladenosine，6-甲基腺嘌呤）是真核生物mRNA內部序列中最常見的一種甲基化修飾，同時可以功能性的調節真核生物的轉錄組從而影響mRNA的剪接、出核、定位、翻譯和穩定性。m6A-RNA出現在多種重要的細胞生命過程中，意味著mRNA甲基化參與了多種生物學過程，如干細胞分化、生物節律等，同時也參與了多種疾病的發生，包括腫瘤、肥胖和不育等。

圖2 RNA甲基化

二、甲基化的生理功能

正常情況下，DNA和RNA甲基化都具有正常的生理功能。

5mC-DNA甲基化能夠調節基因表達水平，例如通過調節DNA對應不同蛋白的表達調節胚胎發育，器官形成等。

m6A-RNA的功能則更為多樣，在多個實驗中觀察到剪接的外顯子和內含子顯著富集了m6A峰，表明m6A與mRNA的選擇性剪接之間的內在聯系。目前推測，m6A對RNA剪接的作用可能是由于甲基化的發生會干擾剪接因子和mRNA之間的結合和相互作用，而m6A簇出現的位置可能恰好為某些RNA結合蛋白的結合位點。

除此之外，m6A還能夠調控mRNA翻譯，大多數m6A修飾發生在外顯子，m6A在剪接后仍保留在成熟的mRNA中，因此，m6A也可以影響含m6A的mRNA的翻譯。但是m6A對蛋白質翻譯的影響似乎在不同的mRNA中是不同的（可能上調，可能下調）。m6A與miRNA結合位點之間的存在著很強的相關性。已有相關證據證明了m6A影響microRNA前體的剪接加工：m6A在轉錄本上的存在會影響選擇性剪接，這種標記的核Readers蛋白能夠介導核轉錄本的處理。另外，m6A也影響了mRNA的穩定性和出核效率。

三、涉足DNA甲基化檢測的企業

由于DNA甲基化的機制和與腫瘤關系更為明確，因此DNA甲基化更早進入產業化并推出了一系列產品。Ribomed、基準醫療和鹍遠基因作為這一領域的代表企業均推出了相關服務和產品。

1、Ribomed

Ribomed開發了專有的檢測技術CAPS檢測DNA甲基化，其靈敏度更高，能夠檢測較小片段DNA（小于50 bp），這些特性使得其技術非常適合液體活檢和切片檢查。其開發的產品GliomaSTRAT，能夠通過甲基化檢測分析和確定神經膠質瘤亞型。

2、基準醫療

基準醫療基于自主研發甲基化建庫技術AnchorIRIS和配套AnchorMonarch分析流程，提供靶向DNA甲基化高通量測序服務，可實現對組織樣本和血液樣本進行DNA甲基化測序，全面分析腫瘤發生、發展中的甲基化變化。該流程可以對新鮮組織，外周血，石蠟組織進行檢測。

圖3 基準醫療甲基化檢測技術（公司官網）

3、鹍遠基因

鹍遠基因則開發了基于高通量測序技術的無創ctDNA甲基化檢測項目-ColonES。該產品可用于人群結直腸癌、結直腸進展期腺瘤（癌前病變）的檢測，進展期腺瘤檢出率大于90%，早期腺癌檢出率大于95%。

圖4 常樂思檢測優勢（公司官網）

四、RNA甲基化檢測和應用的挑戰性

RNA甲基化研究時間較DNA甲基化較晚，且機制更為復雜，目前尚無應用于臨床的產品。我們認為進行RNA甲基化應用的挑戰主要來源于以下幾個方面：

（1）成因更為復雜：m6A甲基化也受甲基轉移酶和去甲基酶的調控但其調控機制卻遠比DNA甲基化復雜得多，因此有許多內容未研究清楚。

圖5 甲基化與腫瘤關系

m6A 甲基化與腫瘤研究進展, 遺傳, 40(12), 2018, 1055

在一定情況下，m6A高甲基化可能指示腫瘤的產生。在早期的基礎研究中，發現m6A甲基化參與了脊椎動物的造血干細胞的分化過程，這提示m6A甲基化很可能與血液系統腫瘤的發生發展有著密切聯系。如METTL3過表達導至甲基化水平上升會促進肝細胞癌(HCC)的增殖和遷移，而降低 METTL3則會抑制細胞的生長和轉移。

而在另一些情況中，m6A低甲基化才是腫瘤的指征。如在宮頸鱗狀細胞癌患者的腫瘤組織中FTO表達顯著升高，使得并發現這些患者對放化療產生了耐受。

總體上講，m6A通過調節mRNA表達水平調控腫瘤，在多種腫瘤中均已發現，但是對應關系不同，且機制復雜，在單一原因確定的腫瘤中可以作為潛在生物標志物，作為治療手段，還需要更多研究數據支持。

（2）檢測操作更為繁瑣：相比于DNA甲基化可以在處理后直接進行PCR，RNA甲基化需要更為復雜的操作。利用甲基化RNA免疫共沉淀結合高通量測序技術，可以對RNA轉錄后甲基化修飾圖譜進行全面研究，是表觀轉錄組學研究的關鍵技術。其中關鍵是利用m6A抗體識別沉淀m6A-RNA序列，具體流程如下圖所示：（1）將待測樣本分離提取獲得RNA序列；（2）打碎RNA獲得碎片；（3）通過抗體捕獲含有m6A的RNA片段；（4）擴增測序，獲得RNA甲基化圖譜。

圖6 m6A甲基化檢測流程

（3）RNA甲基化抑制劑研究較少：在檢測之外，也有一些抑制劑研發工作開展，例如何川課題組利用從惡性膠質瘤病人中分離到的腫瘤細胞，闡述了甲基化酶METTL3，METTL14以及去甲基化酶FTO的抑制劑甲氯芬那酸在該腫瘤中的作用。用FTO抑制劑氯芬那酸處理細胞，提高RNA甲基化水平，抑癌效果明顯。實驗結果展示了m6A可能作為潛在藥物治療靶點。但目前研究力度不足，需要更多基礎研究獲得抑制劑化合物庫進行機制研究和相關實驗。

結語

DNA甲基化和RNA甲基化廣泛存在于生命過程中，并參與了多種疾病特別是腫瘤的產生。其中DNA甲基化成因較為清晰，調控通路較為簡單，已經成為腫瘤早期檢查的重要生物標志物。而RNA甲基化雖然也參與了腫瘤發生發展過程，但是這一過程原因不同且成因復雜，尚不能作為統一治療靶點。不過隨著測序方法的進步，目前對于RNA甲基化的檢測變得成熟簡便，非常利于早起診斷和預后評估，我們認為這一過程的難點不在于數據的獲得，而在于數據的深度分析。如何將獲得的RNA甲基化數據與具體疾病的種類和進程對應起來，并提供類似于DNA甲基化的診斷參考，需要更大量樣本的積累、也需要更多的基礎研究支持、更需要臨床數據分析的進步。