數字PCR或為新冠疑似病人、無癥狀感染病人檢測及確立...

數字PCR或為新冠疑似病人、無癥狀感染病人檢測及確立出院標準提供新方法

近日，南通市第三人民醫院與蘇州銳訊生物科技有限公司運用銳訊DropX數字PCR平臺及試劑盒在大量樣本中開展了新冠肺炎檢測，數字PCR相較于熒光定量PCR體現出了顯而易見的高靈敏度，有效避免了痕量病毒攜帶病例出院風險，并有望為無癥狀感染檢測提供新方法。相關數據已發表在medRxiv。

隨著國內疫情防控進入“下半場”，無癥狀感染者已引起中央高度重視。國家衛健委宣布從4月1日起在每日疫情通報中公布無癥狀感染者情況。這對新冠病毒核酸檢測提出了更高要求。

在南通市第三人民醫院的研究中，研究人員采用銳訊自主設計的4色數字PCR與檢測試劑盒，該試劑盒采用檢測病毒特有基因orf1AB（FAM熒光）和N基因（HEX熒光）以及一個人類基因（Cy5熒光）的手段，有效檢測病毒含量和樣本質量，并能在一個反應中進行三個靶基因的絕對定量檢測，最大程度地滿足高靈敏度COVID-19核酸檢測的需求，同時給出樣本質量的相關數據。

在此項研究中，采用數字PCR法檢測了109例來自于病人咽拭子，肛拭子和血漿樣本中新冠病毒的RNA載量。結果顯示數字PCR靈敏度和精度比熒光定量PCR至少高一個數量級，使COVID-19檢測具有更少的假陰性和假陽性結果，尤其是對于低病毒載量樣本（往往來自于無癥狀感染者，疑似病人和經過治療接近治愈的病人）時展示了顯著的優勢。文章展示了數字PCR在檢測無癥狀患者和疑似患者方面的強大功能的證據。數字PCR能夠通過在PCR反應中直接定量人類RNA的內參基因的含量來檢測核酸反應，可以排除那些因為樣本上樣量不足造成的假陰性結果。同時文章將治療過程中的病人新冠病毒載量的變化用數字PCR和熒光定量PCR進行了對比，發現數字PCR能更穩定和更準確地給出治療過程中病毒載量降低的變化趨勢。另外，文章中也對治療后兩次熒光定量PCR核酸陰性的病人樣本進項了復查，發現少數病例仍然帶有痕量的病毒，這可能也是某些出院病人核酸復陽的原因。

銳訊四熒光數字PCR系統 （FAM/HEX/CY5/ROX） 能夠在單個多路檢測中檢測更多目標基因，提供樣本中病毒載量的定量計數，為新冠病毒的檢測提供了更精準，更靈敏的強大檢測手段。或為解決熒光定量漏檢問題提供更好方案。

目前銳訊生物也是國內唯一推出4色數字PCR檢測設備和新冠COVID-19核酸數字PCR檢測試劑盒產品的商業公司，產品已經在武漢火神山醫院、中國疾控、病毒學國家重點實驗室及多家定點醫院投入使用。

以下是此項研究中的部分實驗數據：在檢測靈敏度的實驗中，對臨床樣本進行梯度稀釋并檢測（S1為原始濃度樣本，S2-S8為梯度稀釋樣本），并同時采用數字PCR和熒光定量PCR檢測，可以看到當樣本濃度逐漸降低的過程中，數字PCR可以檢測到2-3個拷貝的病毒核酸，且整體檢測線性關系更好。而熒光定量PCR在病毒核酸約為20-30左右時ct值為38.5，達到檢測限附近，且擴增的線性關系已經發生較大偏離（上一個5倍的稀釋梯度的ct為35，如果使用ct差異來計算，應為10倍差異）。

圖注：橘紅色為內參基因，綠色為N基因，藍色為COVID-19 ORF1ab 基因。

S1樣本：熒光定量法 Ct=35  數字PCR法檢出

S2樣本：熒光定量法 Ct=38.5  數字PCR法檢出

S3樣本：熒光定量法 未檢出  數字PCR法檢出

S4樣本：熒光定量法 未檢出  數字PCR法檢出

S5-8樣本：數字PCR與熒光定量均未檢出

同時，為了提升對待檢測樣本的質量評估能力，銳訊試劑盒同步引入的Cy5通道作為內參基因使用，在實際臨床樣本S13 樣本為一個新冠確診患者，已經入院接受治療一段時間，接近治愈階段，醫院用qPCR和數字PCR對此例樣本進行檢測，來判斷核酸檢測是否為陰性，病人是否符合出院標準，qPCR 測出了N 和E基因陽性，ORF1ab 基因未檢出。ddPCR ORF1ab和N基因均陽性檢出，同時內參基因濃度很高，證明這個樣本呈弱陽性，病毒載量很低。數字PCR結果顯示病人尚未符合出院標準，體內仍殘留痕量病毒。出院可能會造成復發，感染其他健康人群的風險。如果采用qPCR檢測結果，病人可能會被判為陰性而出院。

S13樣本：熒光定量結果

根據上述對比數據，同樣的試劑盒在銳訊數字PCR平臺上比qPCR平臺靈敏度高至少一個數量級，非常適合CDC或臨檢中心對新型冠狀病毒進行定量檢測；對有接觸史或高危地區無癥狀的“隱形病人”進行排查；對患者治療過程中的病毒載量變化進行動態檢測；對治愈病人進行核酸陰性確認，避免因為檢測靈敏度的問題漏檢某些仍然可能攜帶殘留病毒的病人。

研究中同時表明，某患者于2020年2月4日首次出現發燒、咳嗽和肌肉疼痛癥狀，然后于2020年2月13日住院。然而，在2月14日至2月25日所有6次RT-PCR測試中，RT-PCR的咽拭子呈陰性。CT結果顯示雙肺部都有感染。然而，由于陰性RT-PCR結果，患者被歸類為疑似病例。雖然數字PCR在2月14日，即患者攝入后的第二天出現陰性結果，但從2月18日起，樣本中報告SARS-CoV-2病毒載量低（ORF1ab基因濃度為0.34份/μl，N基因為0.43份/μl）。2月14日的陰性結果很可能是由于樣品加載不足。內部參考基因的濃度僅為1.892拷貝/μl，表明測試中RNA負荷較低。2月18日，數字PCR檢測結果為陽性，內部參考基因濃度為20.8拷貝/μl。研究還表明，2月14日dPCR結果為陰性，原因是RNA負荷不足，可能與樣品核酸萃取過程中樣品采集不當或RNA損失有關。CT掃描結果支持了數字PCR的結論，即該患者感染了新冠病毒，數字PCR核酸檢測為陽性。這名患者接受了莫西氟沙金、阿爾比多爾和普迪蘭的治療。