生物物理所在熱休克蛋白結構功能研究方面取得新進展

　　3月25日，英國皇家學報Philosophical Transactions of the Royal Society B雜志出版了以Assembly chaperones in health and disease為題的專刊，重點報道了在熱休克蛋白、二硫鍵異構酶等分子伴侶結構功能研究方面的最新進展。中科院生物物理研究所生物大分子國家重點實驗室的孫飛課題組與柯莎課題組分別在該專刊上發表了關于熱休克蛋白sHsp16.5和Hsp70方面的最新研究成果。

　　小熱休克蛋白(sHSP)是分子量介于15-30kD的普遍存在的一類蛋白。當一些錯誤折疊的蛋白或受損蛋白可能發生聚集時，小熱休克蛋白能起到一定的抑制作用。同時，它還可以組裝成分子伴侶，調節肌動蛋白，微管等高聚物在細胞中的裝配。其關鍵殘基位點的突變，會導致人體白內障，心肌病等疾病的發生。當外界溫度發生變化時，小熱休克蛋白會對溫度變化產生熱應激性，從而導致其結構隨溫度動態變化。這就給小熱休克蛋白的結構和功能研究帶來了很大的困難和挑戰性。

　　Ure2p是釀酒酵母的prion狀態[URE3]的蛋白決定因子，由N端無規則結構的prion決定域和C端具有GPx和GRX等酶活性的類 GST球形結構域組成。Ure2p可以在體內外聚集形成富含beta折疊結構的淀粉樣纖維，導致釀酒酵母的prion狀態，這種特殊的狀態可以傳播到子代細胞，目前已發現包括Hsp104、Hsp70和Hsp40在內的多種分子伴侶參與調節Ure2p淀粉樣纖維的形成以及其相關prion狀態的傳播。 Ure2p是一個很好的用于研究淀粉樣疾病的模型蛋白。Hsp70是生命活動必須分子伴侶，具有較為保守的結構和功能，由N端具有ATP酶活性的核苷酸結合域(NBD)、C端結合底物的底物結合域(SBD)組成和C末端輔助底物結合的蓋子結構域(CTD)組成，參與蛋白質折疊、解聚，防止錯誤折疊和聚集，與熱激反應和凋亡等多種細胞活動密切相關。Ssa1p是釀酒酵母組成型表達的Hsp70，其絕大部分結構仍未得到解析，其過表達能治愈酵母的[URE3] 狀態。

　　孫飛課題組關于sHsp16.5的研究成果(封面文章)是與英國Durham大學的Roy A. Quinlan實驗室及Ehmke Pohl實驗室合作完成。研究人員利用低溫電鏡單顆粒三維重構技術，解析了野生型小分子熱休克蛋白MjHSP16.5及其突變體R107G(人類同源蛋白在該位點的突變與白內障、原發性心肌癥密切相關)在不同溫度下其組裝24聚體的動態三維結構，發現R107G在60度下的組裝體結構與常溫相比，體積明顯變大，直徑增加1.2nm。而野生型MjHSP16.5組裝體并不表現出此特性。通過晶體結構分析發現，R107位點的突變破壞了該蛋白二體內的一對精氨酸-谷氨酸靜電相互作用，使得該蛋白α-Crystallin結構域柔性增大，容易在高溫下發生結構變化，從而使其組裝體結構膨大。膨大的組裝體可以表現出增強的分子伴侶活性，這一點得到了實驗的印證。該項研究證明了小分子熱休克蛋白中的一些關鍵位點變化可以影響整個組裝體結構的動態和穩定性，從而影響其分子伴侶功能。同時，該研究也展示了低溫電鏡技術在捕捉蛋白質分子動態構象變化方面的優勢。

　　孫飛課題組的助理研究員張艷博士完成了該項研究中的低溫電鏡數據采集和圖像處理分析工作，與英國Durham大學的Roy A. Quinlan教授共同為該文章的第一作者。該項研究工作得到了科技部、國家自然科學基金委、英國領事館舊金山/上海辦事處和英國BBSRC的資助。

　　柯莎課題組關于Hsp70的研究成果是與英國劍橋大學化學系Christopher M. Dobson院士的實驗室及劍橋大學納米科學研究中心合作完成。研究人員使用柯莎實驗室成熟建立的體外淀粉樣纖維形成方法研究了Ssa1p對Ure2p淀粉樣纖維形成過程的影響，發現Ssa1p能顯著延長Ure2p淀粉樣纖維形成的延滯期，無論核苷酸存在與否，抑制效果類似，如果去掉NBD，SBD仍能抑制Ure2p淀粉樣纖維形成，提示核苷酸對淀粉樣纖維這樣較大的底物結合的調節作用可能不明顯。最近，其他實驗室的研究成果顯示Hsp70和成熟蛋白這樣的較大的底物結合受不同核苷酸結合的影響不大，與此結果相映;此外，Ssa1p和它的輔分子伴侶Ydj1p對于Ure2p淀粉樣纖維的抑制作用并沒有明顯的協同作用，Ydj1p H34Q單獨和與Ssa1p一起，都顯示出相對于野生型Ydj1p減弱的抑制Ure2p淀粉樣纖維化的作用;雖然CTD的蓋子結構域不能單獨的抑制 Ure2p的淀粉樣纖維化，但是如果不同程度截短CTD的蓋子結構域，SBD的抑制效應將隨著蓋子結構截短的增加而減弱，提示蓋子結構域輔助淀粉樣纖維底物與SBD的結合。

　　研究人員還借助纖維形成動力學分析方法、石英微晶天平(QCM)、動態光散射(DLS)和pull-down等方法研究了Ssa1p和Ure2p及其成纖維中間產物的相互作用，發現Ssa1p能和Ure2p及其成纖維種子相互作用，濃度依賴性的減慢Ure2p淀粉樣纖維的延伸速率。該工作對于 Ssa1p和Ydj1p抑制Ure2p淀粉樣纖維形成的機制提出了新的觀點。

　　柯莎課題組的博士畢業生徐麗瓊和助理研究員吳思博士共同完成了淀粉樣纖維形成實驗和蛋白質相互作用研究工作，作為并列第一作者，QCM和DLS實驗由英國劍橋大學化學系Christopher M. Dobson院士的實驗室及劍橋大學納米科學研究中心協助完成，柯莎研究員和其課題組的副研究員張紅博士共同指導了相關實驗的完成和文章結構的組織，作為并列通訊作者。該項研究工作得到了科技部、國家自然科學基金委、中科院創新基金和英國皇家學會國際聯合基金的資助。