Biotechniques：如何降低下一代測序1％的堿基錯誤識別？

　　為什么復雜疾病的全基因組關聯研究都是失敗的？

　　下一代測序帶來的誤差，使得我們很難檢測到罕見變異，而這些罕見變異在癌癥等疾病中發揮著重要的作用。

　　在Biotechniques最近的一篇新聞中，Janelle Weaver報道了科學家們在描繪這些誤差以及開發策略提高精度方面所取得的進步。

　　美國國家心臟、肺和血液學研究所(NHLBI)的“Exome Sequencing Project”（外顯子組測序項目）的研究人員在對2400個人的外顯子組進行測序和分析之后推斷：大多數單核苷酸變異是罕見的，在樣本群體中的發生率小于0.5%。

　　這一發現解釋了為什么全基因組關聯研究（GWAS，常見遺傳變異與特定疾病表型相關性）——對于復雜疾病通常是失敗的。

Jan Vijg

　　阿爾伯特·愛因斯坦醫學院（Albert Einstein College of Medicine）的Jan Vijg主要研究"基因組損傷和衰老"之間的關系。他說：“越是罕見的基因突變越發重要，盡管我們不傾向于在常見變異中尋找特定疾病的風險變異，然而很顯然當所有的罕見變異加在一起就會引發了許多疾病表型，因此我們需要研究它們。”

　　盡管下一代DNA測序對疾病相關突變的檢測和個性化醫學發展，具有很大的潛力，但是我們檢測罕見變異的能力，因樣本制備、測序和分析步驟過程中引入的誤差而受到限制。所以這導致了有大約1%的堿基是錯誤識別的。

　　雖然這種誤差率對于某些應用是可以接受的，但是它已經成為癌癥研究人員的一個主要障礙。所以現在，研究人員正在開發新的技術，以準確地識別基因組大海中的罕見變異。

　　目前的方法主要有三點。

　　NO.1 雙重測序——降低誤差率

　　在華盛頓大學，Larry Loeb是一個研究“罕見遺傳變異與癌癥”的研究人員。但是由于以前的測序方法不夠準確，他的實驗室只能研究頻率超過10%的突變。他說：“我們需要一種更準確的方法，可以研究那些可能不會出現在所有腫瘤細胞中的變異——它們可能是亞克隆或隨機的。”

　　Loeb和他的研究團隊描述了這樣一種方法，稱為雙重測序（Duplex Sequencing），相關研究結果發表在2012年的《PNAS》雜志。通過對DNA雙鏈體的兩條鏈進行獨立標記和測序，這種方法實現的理論背景誤差率為，小于每十億個核苷酸序列中有1個人為突變。因此，這種方法對于檢測罕見DNA變異以及單分子計數具有很高的靈敏度，可精確地確定DNA或RNA拷貝數的絕對值。

雙重測序（Duplex Sequencing）

　　在雙重測序中，一段雙螺旋DNA片段的兩條鏈，被附加以一段隨機的、互補的雙鏈核苷酸序列。首先將一段單股的隨機核苷酸序列引入一段接頭鏈，然后用DNA聚合酶產生一段互補的雙鏈標簽，進行延伸，使雙鏈的標簽序列被合并到標準的Illumina測序接頭上。接著，將標簽接頭結扎到剪切的DNA上，然后對單獨標記的鏈，進行PCR擴增和配對末端測序。

　　通過比較雙重測序兩股鏈中每一段所獲得的序列，Loeb及其同事能夠將測序誤差與真正的突變區別開來。由于一個DNA雙鏈體的兩股鏈是互補的，真正的突變位于兩股鏈的同一位置。相反，PCR或測序誤差僅在一條鏈上引發突變，因此可以被視為技術性誤差。

　　Loeb說：“其他最好的方法，可在每一千個核苷酸中引起一個誤差。如果你想測定存在于身體所有細胞中的遺傳異常，這已經足夠好了。但是，如果你想測定罕見變異，或者如果你想要一個腫瘤中的突變分布，或者如果你想測定病毒性種群，這個錯誤率就太高了。”

　　NO.2 添加金屬螯合劑降低DNA氧化偏差——實現精確度

　　雖然科學家們都非常清楚PCR和新一代測序過程中引入的誤差，但是DNA提取和樣本制備過程中產生的誤差卻很少受到關注。麻省理工學院布羅德研究所和哈佛大學的Gad Getz帶領的一個研究小組，2013年在《Nucleic Acids Research》發表的一項研究中解決了這個問題，該研究發現了樣本制備過程中發生的人為突變的一個新來源。

　　根據這項研究，位于超深覆蓋目標捕獲測序數據中低等位基因片段的C>A/G>T顛換偏差，是來自于包含提取過程反應污染物的樣品在進行聲剪切時的DNA氧化。往剪切緩沖液中添加金屬螯合劑，可降低這些氧化偏差，一種后處理過濾法能夠篩選出氧化引起的測序數據誤差。這些研究結果表明，實驗室程序的變化和信息工具的使用，可以幫助研究人員抑制人為偏差的影響。

　　加州大學舊金山分校的Nadav Ahituv，研究基因調控序列在人類生物學和疾病中的作用，他沒有參與這項研究，但是他指出：“人們都知道，使用任何測序技術都有誤差，所以我不認為這有什么驚訝的。這項研究的長處在于，他們針對的是原因，并且提出了很好的計算工具來減少這個問題。”

　　根據卡羅林斯卡醫學院癌癥系統生物學專家Jussi Taipale介紹，除了最近這些研究中描述的實驗和信息學方法之外，還有其他潛在的方法可提高測序的準確度。他沒有參與這些研究，但是他指出：“精確度總是受到聚合酶錯誤率的限制，因為你必須使用它。如果我們能開發一種酶，具有較低的錯誤率，如果我們能處理突變的所有化學來源，那么這當然會提供更多的幫助。”

　　NO.3 臨床影響：雙重測序可以揭示賦予耐藥性的罕見突變

　　像Vijg這些致力于罕見突變的研究人員，可能不需要等待太長時間就能實現這些方法。例如，雙重測序可以適用于各種測序平臺，含有雙鏈標簽序列的接頭，可以代替標準的測序接頭，且不會明顯改變Illumina測序儀樣本制備的正常工作流程。Vijg說：“我們肯定能夠在當前的工作流程中快速地實現它。”

　　也許最重要的是，雙重測序可以揭示賦予耐藥性的罕見突變。Vijg說：“如果我們已經知道，在腫瘤中的某個地方，有一個特定的基因變異，能夠使它們有機會逃脫一種特定藥物，那么我們就可以嘗試另外一種藥物。這可能會對治療產生直接影響。”此外，單細胞測序的未來發展，可能會進一步幫助研究人員確定這些類型的突變。

　　但是雙重測序是否能夠應用于許多類型的突變，仍有待確定。“實際上，他們主要將其應用于小突變——點突變。是否能在大的變化上做到這一點，如大的缺失、易位或拷貝數變異，我還不清楚。”

　　最后，雙重測序可能不會代替標準方法。其中一個原因是，對于全外顯子組測序來說，這種方法過于昂貴。Loeb說：“它對于細胞的測序不均勻混合物或提問的生物學問題，真的很有用，因為它們需要超級精確度。所以，從某種意義上說，雙重測序可能會被限制在癌癥研究、病毒群、古DNA取證之類的事情。”

　　Ahituv認為，各種測序方法將被并行使用。他說：“這兩篇論文最重要的意義在于，如果我們想利用新一代測序技術來尋找罕見基因變異，我們就必須非常小心。”