1190例非綜合征性耳聾患者GJB2基因突變分析

　　耳聾是導致言語交流障礙最常見的疾病。據各國統計，有1/2000-1/1000的兒童出生時為極重度耳聾；同時，一半以上的兒童期耳聾為遺傳因素所致。GJB2基因突變與遺傳性非綜合征性耳聾（NSHI）密切相關。為此，我們對17省市聾啞學校的1190例NSHI患者進行GJB2基因的全序列檢測，以了解中國NSHI患兒的GJB2基因突變特點。為我國GJB2基因突變圖譜的繪制提供一定的基礎。

　　NSHI患者1190例，分別來自北京、河北、黑龍江、吉林、內蒙古、山西、河南、湖北、陜西、甘肅、寧夏、青海、安徽、江蘇、上海、福建、廣東、廣西等地區聾啞學校；年齡1-26歲，平均13.35歲；經病史詢問、全身及耳鼻咽喉專科檢查、純音測聽或腦干誘發電位檢查等確定為重度或極重度非綜合征型雙側感音神經性耳聾。排除：（1）與國外種族聯姻家族史者；（2）外耳、中耳畸形；可能導致傳導性耳聾病史，如有急慢性中耳炎的病史；有中耳或外耳手術史；聲導抗測試結果異常；（3）有其他明確的導致聽力下降的原因（如：細菌性腦膜炎、迷路炎、累及耳蝸的顳骨骨折等）；伴有全身疾病者（如：心臟病、糖尿病等）；（4）影響聽力檢測結果的疾病（如：智力障礙者）；（5）診斷為進行性耳聾的患者（如：自身免疫性內耳病、梅毒性內耳疾病等）；（6）已經明確為綜合征型耳聾患者（如：waardenburg綜合征，Usher綜合征等）。對照組為301例聽力正常且無全身系統疾病兒童。經本院倫理委員會批準，所有家長均簽署知情同意書。

　　試劑盒提取DNA（上海華舜生物工程有限公司），取適量用紫外分光光度計（Beckman Coulter DU800）進行定量和純度檢測，其余保存于-70℃冰箱（SANYO）備用。（2）引物計與合成：GJB2基因的編碼區位于第二外顯子，設計引物為5’TTGGTGTTTGCTCAGGAAGA 3’/5’GGCCTACAGGGGTTTCAAAT3’，擴增片段944bp，擴增產物覆蓋全部編碼區。（3）聚合酶鏈反應（PCR）擴增：通過PCR反應擴增DNA編碼區。在50μl的反應體系中加入100ng的基因組DNA，10倍緩沖液（含MgCl：15 mmol/L）緩沖液5μl，10倍脫氧核苷三磷酸5μl，上下游引物（濃度2μmol/L）各2.5μl，加DNA聚合酶（法特捷，2.5 U/μl）1μl。PCR反應在（美國生物公司ABI 2700）熱循環儀上完成，反應條件為94℃ 5min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環；72℃延伸5min。PCR產物4℃保存。取4μlPCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳（含溴化乙錠0.5μg/ml）檢測產物，擴增片段944bp。（4）PCR產物直接測序：測序引物與PCR擴增引物相同，對PCR產物進行酒精沉淀法純化、Bigdye測序反應PCR（正反雙向）、甲酰胺變性，變性產物應用美國ABI 3100一Avant Genetic Analyzer測序儀進行測序，測序結果使用Genetool Lite軟件包與來自NCBI網站的人類GJB2基因標準序列（ACCESSION：AY280971，VERSION：Y280971．1，GI：33391196）（http：∥www．Ncbi.nlm.nih.gov/~nucleotde&val=33391196）進行比對，發現可疑的突變位點后讀取測序結果的峰圖文件，進行確認或排除。測序反應PCR條件：在10μl的反應體系中加人5 ng的PCR純化產物，單向引物（濃度2 pmol/μl）1.5μl，2．5×Bigdye 0.5μl，5 x緩沖液1.5μl。PCR反應在（美國生物公司ABI 3700）熱循環儀上完成，反應條件為96℃ 1 min；94℃ 10 s，50℃ 5 s，60℃ 4min，25個循環。

　　用SPSS 11.5軟件進行統計學分析，組間比較用χ2檢驗，P<0.05即認為差異有統計學意義。

　　在1190例NSHI患者中，共檢測到16種明確的病理性突變（表1、圖1）。

　　表1 檢測到的病理性突變

　　NT：氨基端，M：跨膜區，EC：細胞外區，CL：細胞內環，CT：羧基端

　　圖1 NSHI患者病理性突變在GJB2基因功能閾的位置及數目。紅色三角所指為GJB2基因突變位點在蛋白結構閾的位置，直方圖上所標數值為相對等位基因數目

　　在NSHI患者中。共檢出250例攜帶明確的GJB2基因突變，占2l .01％（250/1190），其中純合突變98例、復合雜臺突變92例，單雜合突變60例。最常見的突變235delC、299delAT和176del16bp，其中有98％（245例）攜帶3種常見突變中的至少1個突變，占所有檢測人數的20.59％（245/1190）；僅有2％（5例）攜帶其他位點的突變。

　　1190例患者中，GJB2基因最常見的突變為235delC，其中純合突變93例、雜合突變129例，共計222例，檢出率為18.66％，占攜帶明確的病理性突變患者的88．80％（222/250）；其次為299-300delAT，純合3例、雜合59例，共計62例，檢出率為5.2l％，占攜帶明確的病理性突變患者的24.80％（62/250）；176del16bp純合1例、雜合18例，共計19例，檢出率為1.60％，占攜帶明確的病理性突變患者的7.60％（19/250）。由NSHI患者和對照組所攜帶的不同序列改變人數可以看出，兩組間235delC（χ2=58.465，P<0.01），299-300delAT（χ2=10.229，P<0.01）和176del16bp（患者組1.60％，對照組0）的差異有統計學意義。

　　1190例NSHI患者的等位基因總數2380個，檢測到病理性突變等位基因428個，占17.98％（428/2380）；235delC在突變位點中的等位基因檢出率最高，為13.24％（315/2380），占已檢出的突變等位基因比例為73.60％（315/428）；其次為299-300delAT，檢出率為2.73％（65/2380），占已檢出的突變等位基因比例為15.19％（65/428）；176del16bp檢出率為0.84％（20/2380），占已檢出的突變等位基因比例為4.67％（20/428）。

　　在檢測中發現，多數地區GJB2基因病理性突變等位基因的檢出率有共同特點：235delC等位基因的檢出率最高，其次為299-300delAT、176del16bp，其他病理性突變等位基因的檢出率較低，僅青海的299-300delAT的檢出率較高（圖2）。

　　圖2 地區的不同病理性突變等位基因檢出率 每個直方柱表示該地區所有病理性突變的等位基因檢出率，各直方柱中的不同顏色表示該地區不同突變的等位基因檢出率．檢出率=病理性突變等位基因數/該地區等位基因總數

　　在301例正常對照者中，等位基因總數602個；235delC和299-300delAT的等位基因頻率均為0.5％（3/602），未檢測到176del16bp的攜帶者。NSHI患者與正常對照組之間，235delC等位基因頻率（13.24％和0．50％）有統計學意義（χ2=81.818，P<0.01）；299-300delAT（2.73％和0.50％）有統計學意義（χ2=10.749，P<0.01）；35delG、E47X、512insAACG在對照組中也有攜帶，但出現的頻率少，且176del16bp等在對照組中未發現，故未進行統計學處理（表2）。

表2 NSHI患者與正常對照攜帶相同等位基因的不同比例

　　測序圖譜見圖3（略），圖中僅列出相應突變的雜合突變圖譜。

　　現代遺傳學認為，基因是DNA分子上具有遺傳效應的特定核苷酸序列的總稱，是具有遺傳效應的DNA分子片段。基因位于染色體上。并在染色體上呈線性排列，不僅可以通過復制把遺傳信息傳遞給下一代，還可以使遺傳信息得到表達，使遺傳信息以一定的方式反映到蛋白質的分子結構上，從而使后代表現出與親代相似的性狀。基因檢測是通過探測基因的存在，分析基因的類型和缺陷及其表達功能是否正常，來診斷疾病的一種方法。對于耳聾基因的研究可以確定其遺傳方式，并根據其遺傳方式進行早期診斷和早期干預、早期治療及準確咨詢。

　　GJB2基因1993年被克隆，定位于13q11-12，DNA全長4804 bp，編碼區為678 bp。由于蛋白的編碼序列僅存在于一個外顯子，因此很容易通過PCR反應結合測序進行分析。1997年人們發現縫隙連接蛋白（connexin26，Cx26）基因突變與遺傳性非綜合征耳聾密切相關，因而越來越多的學者致力于該基因的研究。免疫組化證實，內耳非感覺上皮細胞和組織連接細胞表達GJB2基因編碼的Cx26蛋白，在聲音傳導過程中，Cx26蛋白對K+經內耳毛細胞循環回流進入耳蝸內淋巴液起調控作用，GJB2基因突變后，K+進入內淋巴液的循環受影響，導致感音神經性聾。為了解我國大多數NSHI患者特有的GJB2基因突變方式、繪制我國NSHI患者的GJB2全序列突變圖譜，也為了配合產前診斷，預防聾兒的出生，我們先期對17省聾啞學校1190例患者進行了GJB2基因的全序列測定，分析其突變特點，并對301例聽力正常兒童進行對照檢測。

　　在本分析中共檢測到病理性突變16種（圖3）。其中W3X、155delTCTG、313del14bp、388del10bp、512insAACG為首次發現的病理性序列改變。W3X（9G>A）使位于第9位的堿基G突變為A，導致GJB2基因的終止密碼子提前至3號，多肽鏈的合成提前終止，翻譯的多肽長度縮短、僅有2個氫基酸，明顯少于野生型蛋白的226個氨基酸，其多肽的各區全部缺失，產生完全無功能的縫隙連接蛋白。155delTCTG、313del14bp、388del10bp、512insAACG等突變的類型與235delC相類似，由于與縫隙連接孔形成或通道的通透性有關，因而以上的缺失或插入突變使遺傳密碼發生框移突變，導致多肽的各區部分或全部缺失，從而產生無功能的縫隙連接蛋白。突變型的蛋白可能喪失了對縫隙連接通道pH值的調控，降低了縫隙連接的通透性，從而導致聽力的下降。其中512insAACG突變僅影響第四跨膜區的形成，對蛋白功能的影響與其他病理性突變相比較小，但純臺突變及復合雜合突變患者的耳聾程度仍為重度或極重度。上述5種序列由于均位于基因的高度保守區，堿基的缺失使終止密碼子提前而使翻譯的氨基酸縮短，導致縫隙連接蛋白功能減退，因此這5種突變序列的出現可以肯定為導致耳聾的原因。

　　本研究中，在檢出的純合突變98例中最常見為235dele純合突變。GJB2基因中有復合突變導致耳聾的報道，本研究中檢出復合雜合突變92例，且大多數突變都是與235delC、299delAT或176del16bp復合存在的。由于兩條等位基因同時存在突變位點時，將不能產生正常的縫隙連接蛋白，因此會導致重度或極重度感音感音性耳聾的發生。

　　在301例正常對照者中，3例攜帶235delC、3例攜帶299-300delAT，等位基因頻率均為0.5％（3/602），未檢測到176del16bp的攜帶者。同時，無純合病理性突變或復合雜合突變者存在。

　　由NSHI患者與對照組所攜帶的不同序列改變人數及等位基因可以看出，兩組間235delC、299-300delAT差異有統計學意義（均P<0．01），176del16bp在對照組中未發現。可以證明235delC是中國NSHl人群中GJB2基因最常見的突變方式，其次為299-300delAT、176del16 bp，其他病理性突變等位基因的攜帶率較低。因此，我們在初期對GJB2基因的篩查方向是完全正確的，在對中國人群NSHI患者的分子學病因進行診斷時，重點檢測的突變位點應為235delC、299-300delAT、176del16bp。GJB2基因在NSHI患者中的高突變率提示該基因突變分析可作為對NSHI患者的常規分子遺傳學檢測手段，可用于產前診斷以降低耳聾的發病率。對預防耳聾家庭再次生育聾兒可以起到明確的指導作用。