南京大學劉震團隊：scPISA用于活細胞低拷貝數蛋白質分析

　　細胞是生物體結構和生命活動的基本單位，基于細胞的研究是生命科學的基礎。然而，由于細胞體積極小，一些重要組分含量極低，細胞微環境的復雜性等等因素使得單細胞分析成為一項十分具有挑戰性的工作。通常的生命科學研究主要以大量細胞為研究對象，但是，這種細胞群體水平的分析掩蓋了細胞個體間存在的顯著微觀不均一性，因而難以反映出單細胞水平真實的生命活動規律。因此，基于單細胞分析的生命科學研究能夠從更深的層次上揭示生命活動的本質和規律，為探究重大疾病的起因、發展和治療提供更可靠的科學依據。

　　蛋白質是生物學功能的直接執行分子，近年來，越來越多的研究表明除了基因突變外，蛋白質的異常也與癌癥的發生發展密切相關。低拷貝數蛋白質，是指在單個細胞內分子數目少于1000個拷貝數的蛋白質，雖然這些蛋白質的豐度極低，但是它們在多種重要的生物學過程中起著關鍵的調控作用。縱觀整個單細胞分析技術領域，蛋白質的分析手段遠遠滯后于基因組和轉錄組的分析方法，其最根本的原因是蛋白質的研究缺少類似于PCR的擴增工具，導致很多低豐度的蛋白質在檢測方面巨大的挑戰。因此，發展適用于單細胞內低拷貝數蛋白質的檢測技術具有重要的科學意義和應用價值。

　　我校化學化工學院生命分析化學國家重點實驗室劉震教授團隊將免疫識別與等離激元拉曼檢測技術相結合，創新性地發展了一種等離激元免疫夾心法（Plasmonic immunosandwich assays, PISA），成功實現了單個活細胞及活體動物內多種低拷貝數蛋白質的分析（Angewandte Chemie International Edition, 2016, 55, 13215）。此后，該方法還擴展到單個活細胞中的microRNA的分析（Chemical Science, 2018, 9, 7241）以及基于生理樣品中的蛋白質和microRNA標志物的疾病診斷分析（Analytical Chemistry, 2016, 88, 12363；Analytical Chemistry, 2019, 2019, 91, 4831；Analytical Chemistry, 2019, 91, 9993；Biosensors and Bioelectronics, 2019, 145, 111729）。同時，該技術還被成功應用于單細胞信號通路研究和抗癌藥物活性評價（Analytical Chemistry, 2020, 92, 12498）等應用。單細胞等離激元免疫夾心法（scPISA）的工作流程示意圖如圖1所示。該方法的原理為：親和配基功能化的金基微萃取探針（尖端約0.5-1微米）在顯微操作系統的控制下，準確地插入單個活細胞內特定部位進行目標蛋白的富集，萃取一定的時間后，將微萃取探針從細胞內拔出，經過適當的清洗步驟降低微萃取探針表面的非特異性吸附，再用親和配基功能化的銀基納米拉曼標簽對富集到的目標蛋白質進行標記，從而在微萃取探針表面形成類似三明治夾心結構的微萃取探針-目標蛋白質-納米拉曼標簽免疫復合物，當激光照射在該免疫復合物的表面，金基微萃取探針和銀基納米拉曼標簽之間納米級間隙內由于等離激元耦合作用產生 “熱點”，顯著地增強納米標簽的表面增強拉曼散射（SERS）信號，靈敏度達單分子水平，從而能夠實現低拷貝數生物分子的檢測。另一方面，基于抗體或人工抗體（包括分子印跡聚合物和核酸適配體）的免疫微萃取以及免疫三明治夾心復合物的技術路徑充分能保證檢測的專一性。

圖1. 單細胞等離激元免疫夾心法的工作示意圖

圖2. 該方法所用的儀器平臺

　　 與現有的單細胞蛋白質分析技術相比，scPISA具有以下明顯的優勢：首先，超高的檢測靈敏度（單分子水平），實現低豐度生物分子的檢測；其次，對目標蛋白質識別的高特異性，保證方法可以應用于復雜的細胞微環境；第三，分析速度快，從活體萃取到拉曼信號的讀出僅需要約6-15分鐘；scPISA是一項微創的技術，經過萃取后細胞仍能存活，可以繼續用于后續研究，該特點在發育生物學及精準醫學領域具有重要的應用價值。此外，scPISA還具有普適性，除了用于蛋白質的分析，還可以用于核酸等其他生物物種的分析，只需要選擇相應的親和配基制備具有靶向識別性能的功能化微探針和納米標記標簽即可。

　　通過單細胞等離激元免疫夾心法，研究人員獲得了單個活細胞中多種低拷貝數蛋白質的諸多重要分子信息，例如低拷貝數蛋白質在單細胞內的表達水平、亞細胞分布等等。這些關鍵信息不僅從分子水平揭示了細胞內蛋白質表達和分布的異質性，也為多種生物學過程以及蛋白相關疾病的發生發展提供了重要信息。在此基礎上，該團隊將該技術應用于單細胞信號通路研究，建立了具有亞細胞分辨率的關鍵信號蛋白及其復合物的測定和多元檢測等方法。該方法有望信號通路研究、為精準藥效評價和個性化藥物篩選等重要應用領域提供新穎可靠的研究手段。

　　2021年6月5日， Nature子刊Nature Protocols在線發表了我校劉震教授團隊在單細胞低拷貝數蛋白質分析的重要研究工作“Probing low-copy-number proteins in single living cells using single-cell plasmonic immunosandwich assays” （https://doi.org/10.1038/s41596-021-00547-9）。該論文的第一作者是劉佳博士，劉震教授為論文的通訊作者。賀暉、謝丹和溫艷蓉為共同作者。該工作得到國家自然科學基金重大科研儀器研制項目和南京大學卓越計劃的資助。

　　論文信息：

　　https://www.nature.com/articles/s41596-021-00547-9

　　Probing low-copy-number proteins in single living cells using single-cell plasmonic immunosandwich assays

　　Jia Liu, Hui He, Dan Xie, Yanrong Wen, Zhen Liu*

　　Nature Protocols, 2021, DOI: https://doi.org/10.1038/s41596-021-00547-9