tRNA測序，約嗎？

　　高通量RNA測序（RNA-seq）技術的使用讓我們認識了細胞中無比精彩的RNA世界。然而，目前的方法無法檢測高度修飾或大量折疊的RNA，如tRNA。近日，《Nature Methods》上的兩種方法通過在文庫制備前去除tRNA的修飾，解決了tRNA測序的技術難題。

　　盡管tRNA被認為是看家RNA，但最近的研究表明，tRNA受到嚴格調控。tRNA表達模式的差異讓增殖和分化細胞表達出不同的翻譯程序。此外，tRNA也能被切割成更小的RNA，其中一些參與了細胞增殖，甚至比microRNA更豐富。這些成果都說明，我們需要更好地了解tRNA如何被調控。

　　傳統的RNA-seq方法大家都清楚，就是在RNA的末端加上接頭，再利用與3’端接頭互補的引物進行逆轉錄。這種方法適用于大多數轉錄本，但tRNA是個例外。因為成熟的tRNA都采用緊湊的三級結構，限制了接頭連接和cDNA合成的效率。其次，每個tRNA上平均有8個或更多的核苷酸是翻譯后修飾的，以確保正確的tRNA折疊。這些包括所謂的“hard-stop”修飾，阻止逆轉錄酶的延伸。因此，傳統的方法不再適用。

　　為了突破這個障礙，兩個研究小組使用大腸桿菌的脫烷基化酶AlkB，去除tRNA中m1A和m3C上的甲基，將其轉化成未經修飾的形式。芝加哥大學的Guanqun Zheng等人還利用突變的酶來處理m1G。通過野生型和突變AlkB的處理，>70%的m1A、m3C和m1G上的甲基化被去除。當然，還有一些hard-stop修飾無法去除。

　　之后，芝加哥大學的研究小組利用一種熱穩定的逆轉錄酶（TGIRT）來代替普通的逆轉錄酶。這種酶是高度進行性的，通過模板轉換的機制來合成cDNA，從而省去了接頭連接的步驟。他們發現，未經處理的tRNA會帶來截短的測序讀取，而AlkB處理明顯增加了全長cDNA的量，讓他們可定量和區分tRNA。

　　第二個研究小組則開發出一種稱為ARM-seq的方法。與第一種方法不同，這種方法需要在成熟RNA的兩端添上接頭。它不如模板轉換高效，但確保只有全長的轉錄本（成熟的tRNA、tRNA前體和tRNA衍生的小RNA）才被PCR擴增和測序。ARM-seq能夠準確捕獲已知的修飾位點，并鑒定出tRNA中的新位點。

　　這兩種方法讓我們能夠全面監控tRNA的水平，并捕捉核苷酸修飾的動態。也許，它們還能應用在之前未發現的其他轉錄本的hard-stop修飾上，包括mRNA和非編碼RNA。