單抗生產工藝的發展趨勢（二）

發布時間：2021-07-01 11:08 原文鏈接：單抗生產工藝的發展趨勢（二）

單抗上下游工藝的現狀和進展

3.1 單抗平臺發展驅動

本節概述了幾家大型生物制藥公司開發并成功地用于大規模生產單抗生產的下游工序。在這些工藝流程中幾個方面是通用的。在哺乳動物細胞培養過程中，單抗被分泌到細胞外的培養基中。收獲和復蘇規程通常采用離心法，然后是深層過濾和一系列的膜過濾器。如果規模較小，可以使用離心分離法，使用一系列的深層過濾器，這些過濾器通常可以重復使用。平臺工藝幾乎都是蛋白質A的親和層析。在某些情況下，可以在蛋白質A層析中增加選擇性洗脫方式，從而進一步增強宿主細胞蛋白(HCP)的清除能力。非蛋白A的方案已經被開發出來并用于某些治療蛋白質商業生產，但由于缺乏通用的方法和處理過程的穩健性，所以尚未普遍應用。按照WHO指導原則，工藝應包含兩個不同原理的病毒清除工序。低pH病毒活性和納濾廣泛應用于單抗生產。低pH經典方法是蛋白從蛋白質A層析洗脫后，立即置換低pH值的緩沖液中。蛋白A親和層析和病毒滅活后，采用一種或兩種精制層析法來清除高分子量聚合體、宿主細胞蛋白、DNA，并清除潛在的病毒。各平臺方法的主要區別在于不同原理精制層析步驟的順序。鑒于目前在工業中日益普遍的高表達細胞培養過程(5-10g/L)，要求精制層析工藝上有很高的柱載量。

每個公司最終都會根據自己的表達系統和細胞培養過程以及他們在研發中主要使用的單抗類型和子類來定制單抗下游平臺的方法。主要的標準是，平臺方法需要在不經過顯著修改的情況下，在廣泛的IgG分子中保持健壯和適用。另一個關鍵的標準是，平臺能夠適應生產進度，并盡可能減少在下游處理過程中所花費的時間。因此，另一個關鍵的驅動因素是各個精制工藝的載量。

3.2 單抗下游平臺現狀

安進公司是率先披露其下游工藝平臺的公司之一。完全模板化的方法被證明是不可行的，但是進行少量的開發實驗即可得到符合要求的工藝參數。這些工藝參數的例子包括：蛋白質的洗脫pH值和洗脫層析步驟的選擇，這取決于需要清除的雜質的主要成分。圖2顯示了當時在安進公司中使用的下游平臺方案。典型的精制工藝通常采用先陽離子交換層析(CEX)吸附模式，再根據需要采用疏水層析(HIC)的流穿模式去除高聚物，或采用陰離子交換層析(AEX)去除HCP。在少數情況下，會使用羥磷灰石以去除特定的與產品相關雜質。經過第一步精制CEX工序使HCP和HMW達到要求后，采用了AEX膜層析作為第二步病毒滅活工藝。

基因泰克公司另一家率先利用平臺方法開發了一種單抗工藝的公司。基因泰克歷史上使用CEX和AEX層析法作為其下游平臺的一部分(圖3)，這一趨勢最初是利用CEX的結合與洗脫模式作為第一個精制步驟，然后AEX流穿模式。一般單抗的pI顯堿性，因此容易與CEX填料緊密結合，也容易在AEX填料中流穿。CEX步驟清除了HMW和HCP。然而，AEX的步驟是需要低電導率才能成功地去除HCP。AEX上樣前需要大體積的儲罐負荷這可能會導至在操作過程中出現瓶頸。使用混合模式的Captoadhere填料代替傳統的AEX填料，有助于減少高倍稀釋的需要。

使用AEX的一個主要缺點是只能清除HCPs而不能清除HMW聚合物。可以在優化AEX工藝，采用弱分離模式可以減小這個缺陷，只是這種情況下會有一部分產品保留在填料上。在這種操作模式下，AEX工藝在去除HCP的同時還可去除部分HMW。我們從結構上推測，在電導率非常低條件，填料骨架的某些疏水性部分相互作用能去除部分HMW。

圖2 安進公司的單抗下游工藝平臺方法

上述兩種方案都有一個缺點，即要求對AEX步驟進行大量稀釋。此外，CEX和AEX通常無法達到足夠的HMW清除效果。

不同單抗HMW水平不一致，但經蛋白質A層析后的HMW的濃度一般不超過5%。這樣的水平常常需要像前面提到的那樣，采用HIC工藝。另一種創新方法是在不加鹽的條件下，高上樣量(200g/L)下進行HIC工藝操作。

這種方法需要使用一種高度疏水性的HIC填料，而不需要增加額外的高滲性鹽。調節上樣前的pH值，以在這種高度過載條件清除HMW。使用這種超高容量的步驟，可以處理大量的單抗，并作為Biogen(圖4)的單抗平臺的一部分，與AEX流穿模式一起使用。超高上樣量精制工藝能力使層析循環數減少，也減少了批生產的上樣時間。

圖3 基因泰克單抗下游工藝平臺

Millipore-Sigma討論過一種幾乎完全采用流穿模式精制的方案。在這種建議中，CEX采用高度過載模式上樣。這樣操作時，CEX有一定能力清除HCP。我們同樣推測，這是由于與層析填料的疏水相互作用造成的。該精制工藝最后以AEX流穿模式完成整個工藝。

圖4 Biogen公司單抗下游工藝平臺

合同開發和制造(CMDO)需要將許多不同的細胞系和細胞培養過程融入到下游平臺方法中。因為需要同時去除HCP和HMW，這對下游平臺方案來說是個重大挑戰。對下游單抗平臺的各種需求如圖5所示。不同的細胞系和培養基種類存在很多的可變性，這些都下游工藝平臺進行處理。因此，兩步精制工藝都需要可以同時清除HMW和HCP。