基于堿基編輯的全基因組擾動文庫構建與篩選技術

　　通過全基因組規模擾動文庫的構建與篩選，從宏觀基因組層面系統研究基因型與表型的對應關系，是微生物功能基因組學研究的重要方法。相較于單個基因擾動文庫的構建與篩選，混合文庫的構建與篩選可通過一次實驗實現特定條件下對上千個基因的同時篩選，顯著提高通量。近年來，CRISPR/Cas技術憑借著精簡高效、可編程、易追蹤的優勢，已逐漸被應用于全基因組規模混合文庫的構建與篩選中。但基于DNA雙鏈斷裂（Double strand break，DSB）的CRISPR/Cas基因編輯方法由于受DSB的毒性影響，需要添加外源DNA模板且對同源重組效率要求較高，在微生物基因組的文庫構建中具有一定的局限性，特別是在同源重組效率普遍偏低的原核生物中更是難以推廣。而基于CRISPR干擾（CRISPR interference，CRISPRi）的文庫構建技術則受干擾效率影響較大，作用于多順反子操縱子時難以定位靶基因。

　　中國科學院天津工業生物技術研究所研究員王猛帶領的高通量編輯與篩選平臺實驗室與生物設計中心平臺實驗室合作，結合胞嘧啶堿基編輯技術以及靶向全基因組的sgRNA混合文庫，以在基因編碼區提前引入終止密碼子的方式，開發了全基因組規模單基因失活文庫的構建方法，并用于功能基因的篩選。該方法不產生DSB、無需添加外源DNA模板、不依賴宿主的同源重組效率，同時具有操作簡單、宿主普適性強、易于推廣等優勢。

　　研究人員以重要的工業生產菌株谷氨酸棒桿菌作為示例，設計了約12000條sgRNA，并構建了覆蓋度為98.1%的全基因組失活文庫。他們將文庫在不同的篩選壓力下進行篩選分析。不同于哺乳動物細胞以及酵母中已報道的數據處理方法，研究人員建立了一套新的sgRNA分析流程，通過對有/無篩選壓力下的樣品進行二代測序分析，根據sgRNA豐度變化，發掘與篩選性狀相關的功能基因。利用上述策略，該研究成功篩選到與5-氟尿嘧啶、5-氟乳清酸抗性，氧化壓力耐受、糠醛耐受相關的基因。其中purU以及serA基因首次被鑒定為與糠醛耐受相關。另外，研究人員開發了FSsgRNA-Analyzer云平臺（https://fssgrna.biodesign.ac.cn/），可加速基于CRISPR/Cas技術篩選的數據處理分析。該研究建立了一種通用性強的基因組文庫混合篩選策略，可加快谷氨酸棒桿菌的基礎和應用研究，同時為其他原核生物提供了技術參考。

　　相關成果發表在Science Advances上。研究工作得到國家重點研發計劃、國家自然科學基金、天津市合成生物創新能力提升行動、中科院青年創新促進會等的支持。

基于堿基編輯技術的谷氨酸棒桿菌基因失活文庫構建與篩選