樊嘉院士楊欣榮教授揭示肝細胞癌CTC空間異質與免疫逃避

　　我國是乙肝大國，肝癌死亡率在我國占惡性腫瘤死亡率的第二位（僅次于肺癌）。在全世界范圍內，肝癌是癌癥相關死亡的第二大原因，其中肝細胞癌（HCC）占病例的90%。雖然經過長期實驗研究，HCC的監測和治療策略有所進步，但由于高復發率和轉移率，HCC的臨床治療結果仍然亟需提升。血源性傳播是HCC轉移的主要途徑，迫切需要深入研究其發生機制以提高肝癌患者的臨床療效。

　　多項研究表明，循環腫瘤細胞（CTCs）是HCC中肝內和肝外轉移（EHM）的“種子”。在傳播過程中，CTCs會受到血液微環境施加的多種類型壓力，包括失巢凋亡、剪切力、氧氣/營養缺乏和免疫監視等，這些壓力都必須在癌細胞成功定植之前克服。因此，針對性地研究CTCs及其在血液擴散過程中的變化，有助于發現腫瘤轉移的新機制。雖然研究人員借助單細胞RNA測序（scRNA-seq）在CTCs分析研究中取得了相當的進步，但關于CTC傳播過程中的轉錄組可塑性和適應性機制的數據還知之甚少。

　　近日，復旦大學中山醫院樊嘉院士、楊欣榮教授團隊合作在Nature Communications發表了題為“Dissecting spatial heterogeneity and the immune-evasion mechanism of CTCs by single-cell RNA-seq in hepatocellular carcinoma”文章。研究團隊利用scRNA-seq檢測了來自HCC患者4個不同血管部位的113個CTC的單細胞轉錄組并構建表達圖譜，發現CTCs之間存在顯著的血管內和血管間部位的異質性。研究發現，CTCs的轉錄動力學與血液運輸過程中的應激反應、細胞周期、免疫逃避信號有關。此外，研究團隊還發現趨化因子CCL5是CTC免疫逃避的重要介質，可通過p38MAX信號招募調節性T細胞（Tregs）促進CTCs的免疫逃逸和轉移。

　　文章發表于Nature Communications

　　該研究收集了10例HCC患者實施根治性切除術前的血液樣本，從肝靜脈（HV）、外周動脈（PA）、外周靜脈（PV）、門靜脈（PoV）4個血管部位的樣本中分離出295個CTC單細胞，并對符合條件的119個CTC進行scRNA-seq分析，篩選出113個合格CTC。

　　隨后，研究人員通過基因集富集分析（GSEA）確定了CTC中上調的分子途徑，包括細胞轉移和侵襲、細胞周期、抗細胞凋亡、免疫反應和促凝信號通路。差異表達分析發現，與侵襲性和轉移有關的基因，例如ACTB、AMIGO2、S100A4在67%的CTCs中被上調；編碼參與能量代謝的基因，包括SLC2A3和PDK1，在大多數CTCs中高度富集；趨化因子信號通路在CTCs中也被上調，包括CCL5、CXCL5和CXCL3（圖1）。

　　圖1.基于RNA-seq表達的原發性腫瘤、原發性腫瘤和肝癌細胞株的基因差異表達特征。

　　研究團隊分析10名患者CTCs的t-SNE圖發現，從不同血管隔室分離出來的CTCs按患者來源聚集在一起，表明患者間的異質性高于血管隔室的異質性。為進一步探究CTCs在轉移過程中的空間轉錄異質性，研究團隊分析了同一患者四個不同血管部位特異性表達的CTC基因譜，發現每個血管部位分別富集了與氧化磷酸化/異生物質代謝（HV）、GPCR信號傳導（PA）、免疫反應/細胞因子產生（PV）和細胞周期（PoV）有關的基因。表明CTCs具有明顯的血管內和血管間異質性，并且HV CTC異質性最高（圖2）。

　　圖2.CTC的空間轉錄異質性。

　　研究人員對相鄰兩個關鍵血管部位的CTC表達譜進行了差異基因分析，發現不同循環部位之間的CTC呈現出轉錄組的時空動態變化特征。CTC的轉錄活性在PA中降低，但在PV和PoV中增加。其中最顯著的表達變化發生在HV和PA區域之間（圖3）。

　　從HV到PA的過程中，CTC的整體轉錄活性降低，下調基因富集在細胞生長和增殖等信號通路，以及MYC靶基因和G2/M檢查點相關基因；上調基因包括上皮間質轉化（EMT）相關基因（如SPARC和IGFBP2）和與腫瘤細胞-血小板微聚集物的形成（如GP1BA和VWF）、免疫抑制性趨化因子有關的基因。上述結果表明，所有生物過程都可能賦予CTC免疫逃避優勢，使其在遇到外周細胞毒性免疫細胞時能夠存活下來，這對成功的CTC介導的轉移至關重要。

　　圖3.單個CTC轉錄組的動態突出了循環過程中應激反應和細胞周期異質性的路徑改變。

　　為了探究促進CTC免疫逃避能力的關鍵基因，研究團隊分析了免疫逃避相關基因及細胞因子在原發性腫瘤和CTC中的差異表達（圖4）。結果顯示，免疫抑制趨化因子CCL5在上調表達基因中位列第一，并且在CTC從HV至PA、PV和PoV過程中保持相對較高的表達水平，這一發現也通過IF分析得到驗證。

　　通過對已發表的實驗數據進行分析，研究發現，CCL5的表達與HCC腫瘤組織和PoV 腫瘤血栓中的Tregs（FOXP3）呈正相關，并通過TCGA數據集分析證實Treghigh/CCL5+CTChigh是早期復發最強的獨立預后因素。此外，體外和體內模型結果表明，CTC可通過CCL5來募集Tregs，從而抑制殺傷性CD8+ T細胞的功能，在轉移定植過程中建立有利于其生存的局部微環境。

　　圖4. CTCs與循環Tregs呈正相關，可預測HCC患者術后復發。

　　為確定誘導CCL5表達的關鍵轉錄因子（TFs），研究人員在CTCs中篩選了43個與CCL5水平呈正相關的TFs，其中相關性最高的是MYC-associated factor X（MAX）。此外，對 CTCs中上調的基因組進行KEGG分析后發現p38 MAPK信號顯著增強，且p38-MAX 信號激活在控制CCL5轉錄中有著重要作用。

　　該研究利用scRNA-seq破譯了CTCs表達譜，并證實CTC之間的空間轉錄異質性及轉移機制。研究發現，CCL5是CTC免疫逃避的重要調節因子，CCL5在CTC中的過度表達受到p38-MAX 信號的轉錄調控，p38-MAX 信號通過調節調節Tregs來促進免疫逃逸和CTCs的轉移。總而言之，該研究揭示了原發性肝癌的空間異質性和免疫逃逸機制，有助于設計新的抗轉移治療策略。