特異性檢測溶酶體亞硫酸氫鹽新武器：新款智能熒光探針

　　文章提出了一種新的基于邏輯與的熒光探針(NY-Lyso)，它由嗎啉基、半花菁苷和1,8-萘二甲酰亞胺顯色團組成，用于特異性檢測溶酶體中的亞硫酸氫鹽。該智能探針由兩個功能部件組成：NY-Lyso探針上的嗎啉基對細胞內溶酶體(pH 4.5-5.5)和其他細胞器之間的pH差異產生敏感反應，噻吩和花菁之間的碳碳雙鍵通過親核加成選擇性地與HSO₃^-反應。

　　嗎啉基和半花菁苷均能通過光誘導電子轉移(PET)和分子內電荷轉移(ICT)機制獨立淬滅發射，因此探針無熒光。當同時存在SO₂和H⁺時，探針在524nm處表現出強烈的熒光發射。也就是說，只有當SO₂和pH同時被認為是“輸入”時，熒光發射才會被“輸出”。值得注意的是，基于該方法的探針不僅具有高選擇性、快速響應(小于200s)、極低的檢測限(LOD = 20.7nM)和優良的溶酶體靶向性的優點，而且克服了在復雜的細胞pH環境中檢測HSO₃^?的局限性。與以前報道的用于SO₂衍生物的生物探針相比，基于邏輯與的熒光探針在性能和應用上都有明顯的優勢。

圖一. NY-Lyso的化學結構及其對HSO₃^-的傳感機理(圖片來源：Anal. Chem. 2019, 91, 11946?11951)

　　探針由兩個功能部件組成:溶酶體靶向基團嗎啉基和亞硫酸氫鹽的特異性結合位點。該設計策略允許探針同時具有兩個響應位點，分別通過PET和ICT控制萘酰亞胺熒光團的熒光。在亞硫酸氫鹽存在下，半花菁苷的共軛結構被破壞，通過抑制ICT過程導致熒光強度的部分增強。當將SO2探針復合物暴露在酸性環境中，如溶酶體，嗎啉基團將被質子化，PET過程也被阻斷，然后導致發射強度顯著增加。

　　由于溶酶體pH值在4.5到5.5之間，作者首先研究了在HSO₃^-存在和不存在的情況下，pH值對探針NY-Lyso光物理性質的影響。如預期的那樣，結果表明pH對探針的作用非常重要。pH = 7.0時，在沒有HSO₃^-的情況下，NY-Lyso由于PET和ICT不發出熒光。當加入HSO₃^-時，發射強度仍然保持在一個較低的值，說明PET過程仍然在起作用。當pH值下降到6.0，對嗎啉基團內的N原子的質子化作用阻礙了PET的作用,導致了在524 nm(Φf = 0.49)出現顯著的發射增強。隨著體系酸度的增加，HSO₃^-會優先被H⁺捕獲，導致親核加成過程受阻，ICT過程被重新激活。為了驗證這一機理，作者測試了一系列萘酰亞胺模型的光物理性質。這些結果表明，NY-Lyso可作為pH活化熒光探針用于檢測HSO₃^-，在中性和堿性條件下保持沉默，在弱酸性條件下選擇性熒光激活。隨后，通過測量NY-Lyso在PBS溶液(10mm, 5% DMSO, pH = 5.5)中的吸收和熒光光譜變化，檢測其對HSO₃^-的光學響應。探針NY-Lyso(10μM)顯示主要吸收在475nm。加入HSO₃^-(0?10當量)后，475 nm處的峰值逐漸減小，顏色由淡黃色變為無色。這些變化可能是由于HSO₃^-阻斷了半花菁苷的共軛結構，從而阻斷了ICT通路，因此探針的吸收光譜發生了顯著的藍移。且NY-Lyso(10 μM)幾乎沒有熒光發射。隨著HSO₃^-濃度的增加，在380 nm激發下，524 nm處出現明顯的熒光。當十倍當量HSO₃^-添加時,熒光強度達到最大。此外，通過分析探針在524 nm處的熒光強度，研究了探針的反應動力學。在不同濃度的HSO₃^-(0 -60 μM)的條件下，隨著反應時間逐漸增加，探針的熒光強度也逐漸增加,并在200 s達到平衡,并可以保持超過60分鐘的穩定。實驗表明，該探頭對SO²的響應速度快，可用于SO²的實時成像。

圖二. PBS溶液(10mM,5% DMSO, pH = 5.5)中NY-Lyso(10 μM)在不同濃度的HSO3-(0-100μM)下的紫外光譜變化以及熒光光譜變化 (圖片來源：Anal. Chem. 2019, 91, 11946?11951)

　　根據上述結果，作者通過記錄四種可能輸入條件下的熒光光譜，確定了探針在PBS緩沖液中的邏輯與特性。其中，H⁺和HSO₃^-為輸入，系統524 nm處的發射強度為輸出。對于輸入，存在和不存在H⁺或HSO₃^-分別定義為“1”和“0”。輸出熒光“ON”和“OFF”分別定義為“1”和“0”。當有兩個輸入(1/1)時，熒光強度急劇增加，輸出信號為“1”。否則，在其他情況下(沒有輸入或僅輸入一個1)，熒光輸出為“0”。

圖三. 具有兩個輸入值的邏輯與門的邏輯方案和真值表 (圖片來源：Anal. Chem. 2019, 91, 11946?11951)

　　在細胞外酸性條件下，NY-Lyso對亞硫酸氫鹽具有良好的光物理特性和響應性能，因此作者繼續探索NY-Lyso對活細胞溶酶體中亞硫酸氫鹽成像的能力。作者首先對探針進行細胞毒性實驗，探針對HeLa細胞的細胞毒性較低，說明NY-Lyso適用于活體細胞成像。與其他含有嗎啉基團的溶酶體靶向探針相似，引入嗎啉基團顯著增加了探針在溶酶體富集的可能性。為了研究NY-Lyso的溶酶體靶向性，進行了共定位實驗。HeLa細胞與探針NY-Lyso(10 μM), HSO₃^-(20 μM)和Lyso-Tracker(0.5 μM)在室溫下一起孵育30分鐘。如圖4所示，細胞在顯微鏡下顯示了來自NY-Lyso的綠色熒光通道，以及來自商業Lyso-Tracker的紅色熒光通道。合并后的圖像顯示兩個通道重疊良好， Pearson共定位系數為0.85，證實NY-Lyso可以在活細胞溶酶體中特異性定位。隨后，研究了探針對細胞內HSO₃^-的檢測和成像能力。為了測試探針在細胞中的邏輯與特性，作者必須首先調節細胞內外的pH值。一種常用的方法是使用高鉀離子緩沖液將細胞的外部pH值維持為一個固定值，然后使用一種K+/H+離子載體的尼日利亞菌素將細胞內部的pH值調節到相同的pH值。此外，分別用20 mM檸檬酸和20 mM HEPES制備pH為5.5和7.4的緩沖液。那么對于H⁺， pH值在5.5和7.4可以分別定義為1和0。HSO₃^-HSO3的存在和不存在也分別定義為1和0。如圖5所示，作者將細胞分為(1,0)、(0,1)、(1,1)三組，但在未處理的細胞和僅與HSO₃^-孵育的細胞中，細胞上沒有熒光。相比之下,用50μM HSO₃^-孵化后細胞在pH值5.5成功地觀察到524 nm的強烈綠色熒光。通過與細胞外實驗結果的比較，作者成功地研制了一種基于邏輯與的熒光探針，用于活細胞中HSO3-的選擇性檢測。

圖四. 不同的pH值下NY-Lyso (10 μM)在HeLa細胞中對HSO3-成像的邏輯與行為 (圖片來源：Anal. Chem. 2019, 91, 11946?11951)

　　總結：綜上所述，華東理工大學朱為宏、王成云、郭志前課題組開發了一種基于邏輯與的熒光探針NY-Lyso，通過PET和ICT機制的調控來檢測HSO3-。該探針對HSO3-具有較高的選擇性和敏感性(LOD = 20.7 nM)。探針的邏輯與行為允許其熒光在中性或堿性條件下保持沉默，但被低pH和HSO₃^-的共刺激激活。此外，它被證實具有生物相容性，可用于監測活細胞中的溶酶體HSO₃^-。與傳統探針相比，該探針和基于邏輯與的探針避免了細胞環境中復雜的相互作用，具有更好的選擇性和更高的靈敏度。該方法具有較強的可實現性和實時性。

　　備注：邏輯代數有與、或、非三種基本邏輯運算。它是按一定的邏輯關系進行運算的代數，是用來分析和設計數字電路的數學工具。有三種最基本的邏輯運算：

　　（1）邏輯與：當A，B都為1時，其值為1，否則為零；

　　（2）邏輯或：當A，B都為0時，其值為0，否則為1；

　　（3）邏輯非：當A=0時，A的非為1，A=1時，A的非為0。