細胞培養技術

實驗概要

細胞培養是指從體內組織取出細胞摹擬體內出現環境，在無菌、適當溫度及酸堿度和一定營養條件下，使期生長繁殖，并維持其結構和功能的一種培養技術。細胞培養的培養物為單個細胞或細胞群。

主要設備

細胞培養設施和基本條件

　　1、實驗室設計

　　細胞培養是一種無菌操作技術，要求工作環境和條件必須保證無微生物污染和不受其它有害因素的影響。細胞培養室和設計原則是防止微生物污染和有害因素影響，要求工作環境清潔、空氣清新，干燥和無煙塵。細胞培養工作包括：工作液配制、無菌操作（采樣）、溫育、無菌處理，細胞和用品貯存等。細胞培養室的設計實施原則一般是無菌操作區設在室內較少走動的內側，常規操作和封閉培養于一室，而洗刷消毒在另一室。

　　2、常用設施及設備

　　（1）超凈工作臺：也稱凈化工作臺，分為側流式、直流式和外流式三大類。

　　（2）無菌操作間：一般由更衣間、緩部間和操作間三部分組成。操作間放置凈化工作臺及二氧化碳培養箱、離心機、倒置顯微鏡等。緩沖間可放置電冰箱、冷藏器及消毒好的無菌物品等。

　　（3）操作間：普通培養箱、離心機、水浴鍋、定時鐘、普通天平及日常分析處理物品。

　　（4）洗刷消毒間：烤箱、消毒鍋、蒸餾水處理器及酸缸等。

　　（5）分析間：顯微鏡、計算機及打印機等。

　　3、培養器皿

　　細胞培養以玻璃器皿為主，常準備最需是使用最的三倍。器皿應選擇透明度好、無毒、中性硬度玻璃制品。常用的玻璃器皿有下面幾種。

　　（1）液體儲存瓶：用于儲存各種配制好的培養液、血清等液體，常以500ml、250ml、100ml生理鹽水瓶或血漿瓶代替。

　　（2）培養瓶：根據培養細胞種類要求不同培養瓶的形態各異，用于細胞傳代培養的細胞要求瓶壁厚簿均勻，便于細胞貼壁生長和觀察，瓶口要大小一致，口徑一般不小于25px，允許吸管伸入瓶內任何部位，規格有200ml、100ml、50ml、25ml、10ml等幾種。用于外周血培養的常用10ml普通圓瓶。兩種培養瓶均要求選用優質玻璃制成。

　　（3）培養皿：用于開放式培養及其它用途。分直徑30mm、60mm、120mm等幾種。

　　（4）吸管：常用的有長吸管和短吸管兩類，長吸管也稱刻度吸管。其改良后管上部有球型刻度稱改良吸管，刻度吸管用于移動液體。常用1ml和10ml兩種。短吸管也叫滴管，分彎頭和直頭兩種。

　　（5）離心管：離心管是細胞培養中使用最廣泛的器皿，根據用途不同形態各樣，常用于細胞培養的離心管有大腹式尖底離心管和普通尖底離心管兩類。前者分別為50ml、30ml、15ml；后者則多為10ml和5ml。

　　（6）其它：如三角燒瓶、燒杯、量筒、漏斗、注射器等。

實驗步驟

      在醫學遺傳學研究中應用最廣泛的是外周血淋巴細胞、皮膚或纖維細胞和各種能在體外長期生長的細胞系。外周血淋巴細胞培養具有時間短、技術簡便、可重復取材等優點，它在臨床染色體分析中使用最廣泛。體外培養細胞株可在培養過程中發生自發的或在外界作用下的轉化，成為永久細胞系，也可直接建成永久細胞系，永久細胞系能在體外無取制的傳代和生長。永久細胞系通常具有非整倍體細胞和各個細胞的核型不完全相同特征。但細胞克隆的細胞系其這一特征可以不明顯。

一、細胞培養的環境

　　細胞在體外培養中所需的條件與體內細胞基本相同。

　　1、無污染環境

　　培養環境無毒和無菌是保證細胞生存的首要條件。當細胞放置于體外培養時，與體內相比細胞丟失了對微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代謝物質積累等，可導致細胞死亡。因此在進行培養中，保持細胞生存環境無污染、代謝物及時清除等，是維持細胞生存的基本條件。

　　2、恒定的溫度

　　維持培養細胞旺盛生長，必須有恒定適宜的溫度。人體細胞培養的標準溫度為36.5℃±0.5℃，偏離這一溫度范圍，細胞的正常代謝會受到影響，甚至死亡。培養細胞對低溫的耐受力較對高溫強，溫度上升不超過39℃時，細胞代謝與溫度成正比；人體細胞在39-40℃1小時，即能受到一定損傷，但仍有可能恢復；在40-41℃1小時，細胞會普遍受到損傷，僅小半數有可能恢復；41-42℃1小時，細胞受到嚴重損傷，大部分細胞死亡，個別細胞仍有恢復可能；當溫度在43℃以上1小時，細胞全部死亡。

　　3、氣體環境

　　氣體是人體細胞培養生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。氧氣參與三羧酸循環，產生供給細胞生長增殖的能量和合成細胞生長所需用的各種成分。開放培養時一般把細胞置于95%空氣加5%二氧化碳混合氣體環境中。

　　二氧化碳既是細胞代謝產物，也是細胞生長繁殖所需成分，它在細胞培養中的主要作用在于維持培養基的PH值。大多數細胞的適宜PH為7.2-7.4，偏離這一范圍對細胞培養將產生有害的影響。但細胞耐酸性比耐堿性大一些，在偏酸環境中更利于細胞生長。有資料顯示，原代羊水細胞培養PH6.8時最適。

　　細胞培養液PH濃度的調節最常用的為加NaHCO3的方法，因為NaHCO3可供CO2，但二氧易于逸出，故最適用于封閉培養，而羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）因其對細胞無毒性，也起緩沖作用，有防止PH迅速變動的特性而用于開放細胞培養技術中，其最大優點是在開放式培養或細胞觀察時能維持較恒定的PH值。

　　4、細胞培養基

　　培養是既是培養細胞中供給細胞營養和促使細胞生殖增殖的基礎物質，也是培養細胞生長和繁殖的生存環境。培養基的種類很多，按其物質狀態分為半固體培養基和液體培養基兩類；按其來源分為合成培養基和天然培養基。

　　（1）合成培養基：合成培養基是根據細胞所需物質的種類和數量嚴格配制而成的。內含碳水化合物、氨基酸、脂類、無機鹽、維生素、微量無素和細胞生長因子等。單獨使用細胞雖有生存但不能很好的生長增殖。

　　（2）天然培養基：使用最普遍的天然培養基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多種細胞生長因子、促貼附因子及其多活性物質。與合志培養基合用，能使細胞碩利增殖生長。常見使用最為5-20%。

二、培養細胞形態

　　體外培養細胞根據它們在培養器皿是否能貼附于支持物上生長特征，可分為貼附型生長和懸浮型生長兩大類。貼附型細胞在培養時能貼附在支技物表面生長。如羊水細胞為貼附型細胞，常表現為成纖維型細胞和上皮細胞生長。懸浮型細胞在培養中懸浮生長。

　　1、成纖維型細胞

　　在培養中的細胞凡形態與成纖維細胞類似時，皆可稱之為成纖維細胞。本型細胞由形態與體內成纖維細胞的形態相似而得名，細胞在支持物表面呈梭形或不規則三角形生長，細胞中央有卵園形核，胞質向外伸出2-3厘米個長短不同的突起，除真正的成纖維細胞外，凡由中胚層間質起源的組織細胞常呈本類形態生長。

　　2、上皮型細胞

　　此類型細胞在培養器皿支持物上生長具有扁平不規則多角形特征，細胞中央有園形核，細胞緊密相連單層膜樣生長。起源于內、外胚層細胞如皮膚、表皮衍生物、消化管上皮等組織細胞培養時，皆呈上皮型形態生長。

　　3、游走型細胞

　　本型細胞在支持物上散在生長，一般不連成片。細胞質經常伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運動，速度快且不規則。此型細胞不很穩定，有時亦難和其它型細胞區別。在一定的條件下，由于細胞密度增大聯成片后，可呈類似多角型或成纖維細膩包形態。常見于羊水細胞培養的早期。

五、培養細胞形態分析

　　培養細胞隨貼附支持物形狀不同而形態各異，最常見的是貼附于平面支持物細胞。在一般光鏡下生存中的細胞是均質而透明的，結構不明顯。細胞在生長期常有1-2個核仁在細胞機能狀態不良時，細胞輪廓會增強，反差增大。若胞質中時而出現顆粒、脫滴和腔泡等，表明細胞代謝不良。

三、培養用品的清洗與消毒

　　目前我國細胞培養器皿主要仍使用能反復使用的玻璃器皿，清洗的主要目的為清除雜質和微生物，使在器皿內不殘留任何影響細胞生長的成份。因而在組織細胞培養中清洗和消毒是一項極為重要的環節。

　　（一） 清洗

　　在組織細胞培養中，體外細胞對任何有害物質都非常敏感。微生物產品附帶雜物，上次細胞殘留物及非營養成分的化學物質，均能影響培養細胞的生長。因此對新使用和重新使用的培養器皿都要嚴格徹底的清洗，且要根據器皿的組成材料不同，選擇不同的清洗方法。

　　1、玻璃器皿的清洗

　　組織細胞培養中，使用量最大的是玻璃器皿，故工作最最大的是玻璃器皿的清洗。一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、侵酸和沖洗四個步驟。清洗后的玻璃器皿僅要求干凈透明無油跡，而且不能殘留任何物質。

　　（1）浸泡：初次使用和培養使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附著物軟化或被溶液掉。新的初次使用的玻璃器皿，在生產及運輸過程中，玻璃表面帶有大量的干固的灰塵，且玻璃表面常呈堿性及帶有一些對細胞有害的物質等。新瓶使用前應先用自來水簡單刷洗，然后用稀鹽酸液（5）浸泡過夜，以中和其中的堿性物質。再次使用的玻璃器皿則常附有大量剛使用過的蛋白質，干固后不易洗掉，故用后要立即浸入水中，且要求完全浸入，不能留有氣泡或浮在液面上。

　　（2）刷洗：浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗滌劑刷洗，以除去器皿表面附著較牢的雜質。刷洗要適度，過度會損害器皿表面光澤度。

　　（3）浸酸：清潔液是由重鉻酸鉀、濃硫酸和蒸餾水按一定比例配制而成，其處理過程稱為浸酸。清潔液對玻璃器皿無腐蝕作用，而其強氧化作用可除掉刷洗不掉的微量雜質。清潔液去污能力很強。是清洗過程中關鍵的一環。浸泡時器皿要充滿清潔液，勿留氣泡或器皿露出清潔液面。浸泡時間一般為過夜，不應少于6小時。  清潔液可根據需要，配制成不同的強度，常用的下列三種： 重鉻酸鉀（g） 濃硫酸（ml） 蒸餾水（ml） （A）強清潔液 63 1000  200000 B）次強清洗液 120 200 1000 （C）弱清潔液 100 100 100

　　清潔液配制時應注意安全，須穿戴耐酸手套和圍裙，并要保護好面部及身體裸露部分。配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產生的熱量揮發，配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產生的熱量揮發，配制溶液應選擇塑料制品。配成后清潔液一般為棕紅色。

　　（4）沖洗：玻璃器皿在使用后，刷洗及浸泡后都必須用水充分沖洗。使之盡量不留污染或潔液的殘跡。沖洗最好用洗滌裝置。即省力、效果又好。如用手工操作，則需流水沖洗十次以上，每天水須灌滿及倒干凈，最好用蒸餾水清洗3-5次，晾干備用。

　　2、膠塞的清洗

　　細胞培養中所用的橡膠制品主要是瓶塞。新購置的瓶塞帶有大量滑石粉及雜質，應先用自來水沖洗，再做常規處理，常規清洗方法是：每次用后立即置入水中浸泡，然后用2%   NaOH或洗衣粉煮沸10-20分鐘，以除掉培養中的蛋白質。自來水沖洗后，再用1%稀鹽酸浸泡30分鐘或蒸餾水沖洗后再煮沸10-20分鐘，晾干備用。

　　3、塑料制品的清洗

　　塑料自制品現多是采用無毒并已經特殊處理的包裝，打開包裝即可用，多為一次性物品。必要時用2% NaOH浸泡過夜，用自來水充分沖洗，再用5%鹽酸溶液浸泡30分鐘，最后用自來水和蒸餾水沖洗干凈，晾干備用。

　　（二）消毒

　　細胞培養的最大危險是發生培養物的細菌，真菌和病毒等微生物的污染，污染主要是由于操作者的疏忽而引起，常見的原因有操作間或周圍空間的不潔，培養器皿和培養液消毒不合格或不徹底，由于有關培養的每個環節的失誤均能導致培養失敗，故細胞培養的每個環節都應嚴格遵守操作常規，防止發生污染。

消毒方法分為三類： （A） 物理滅菌法（紫外線、濕熱、過渣等）。 （B） 化學滅菌法（各種化學消毒劑）。 （C） 抗生素。

　　（1）紫外線消毒：用于空氣，操作臺表面和不能使用其它法進行消毒和培養器皿。紫外線直接照射方便、效果好，經一定的時間照射后，可以消滅空氣中大部分細菌，培養室紫外線燈應距地面不超過2.5米，且消毒進物品不宜相互遮檔，照射不到的地方起不到消毒作用。

　　紫外線可產生臭氧，污染空氣，試劑及培養液都有不良影響，對人皮膚也有傷害，不宜近照射也進行實驗操作。

　　（2）溫熱消毒：即高壓蒸氣消毒，是一種使用最廣泛、效果最好的消毒方法。溫熱消毒時，消毒物品不能裝得過滿，以防止消毒器內氣體阻塞而千百萬危險，保證其內氣體的流通。在加熱升壓之前，先要打開排氣閥門排放消毒器內的冷空氣，冷氣空氣排出后，關閉排氣閥門，同時檢驗安全閥活動自如，繼后開始升壓，當達到所需壓力時，開始記算消毒時間。消毒過程中，操作者不能離開工作崗位，要定時檢查壓力及安全，防止消毒及表皮意外事件發生。

常用物品消毒壓力及時間：

　　培養液、橡膠制品、10磅10分鐘；

　　布類、玻璃制品、金屬器械、18磅20分鐘。

　　上兩種是最常見的物理消毒方法。

　　（3）化學消毒法：最常見的是70%酒精及1‰的新潔而滅，前者主要用于操作者的皮膚，操作臺表面及無菌室內的壁面處理。后者則主要用器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦試消毒。化學消毒法操作簡單、方便有效。

　 （4）抗生素消毒：確切應記成抗生素滅菌，主要用于培養用液滅菌或預防培養物污染。