細胞培養攻略：細節決定成敗

　　培養細胞就像養育BABY一樣，要精心照料，用心呵護。最好每天都去看看它們，滿足它們所需要的物質需求，防止出現培養箱缺水、二氧化碳不足、溫度不夠等各種小意外，還要注意很多小細節，以免開展重復的實驗導致不必要的人力物力浪費。

　　那培養細胞都要注意哪些小細節呢？就讓我們一起來看看吧！

　　1.細胞生長的營養來源

　　不同的細胞的培養基是不相同的，對于大多數腫瘤細胞來說，營養配方一般為：90%合成培養基（DMEM、RPMI1640、MEM等）和10%胎牛血清(FBS)；為了防止污染，可以適時加1%雙抗，抗生素的使用應為短期。

　　Q：細胞培養基配方如何選擇？

　　A: 一般購買細胞時，針對不同的細胞株，會有詳細的介紹，包括生長的狀態圖、培養基的類型等。如人源肺癌細胞A549可用DMEM培養基，在胎牛血清的選擇上也可以選用大品牌、來源可靠的胎牛血清，能提供較好的營養成分，以滿足細胞株生長的需要。

　　Q：如果細胞生長緩慢，需要增加血清比例嗎？

　　A：可以。

　　2.細胞生長的環境

　　舒適無菌的環境是細胞健康生活的重要基礎。需要合適的器皿，不同形狀、規格、用途多樣的培養皿、培養瓶及培養板等，最終進入合適的恒溫箱培養，如腫瘤細胞就需37℃，5%CO2的恒溫箱中生長。

　　Q：細胞培養板及培養皿或培養瓶如何選擇？

　　A：根據不同的應用選擇不同的培養皿或容量板，如MTS用96孔板，細胞爬片用24孔，流式分析用6空等，具體應用可參見下表：

　　而選擇培養皿還是選擇培養瓶，就細胞培養狀態來說差別不大，主要是培養瓶的安全系數更高一些，數量也會大一些，但是成本也相對較高，因此沒有特殊要求時，一般用培養皿即可。

　　Q：血清是否要滅活處理，保證環境無菌？

　　A：這取決于您的應用。

　　滅活過程中，會導致血清中某些成分被破壞，如氨基酸，維生素，生長因子等。所以只有在您的實驗對血清有特殊要求時，才會考慮對血清進行滅活處理。如您的實驗對血清中的某種組分敏感，需要去除該組分。最常見的情況是需要去除血清中的補體蛋白，因為補體在機體中參與細胞殺傷，巨噬細胞和淋巴細胞活化，肥大細胞和血小板組胺釋放，平滑肌收縮等過程，所以一般在免疫學相關研究中及肌細胞和干細胞的培養過程中需要對血清進行滅活處理。

　　另外，用gamma 射線輻照血清可滅活血清中的病毒，一般情況下，25-40kGy和30-45kGy是常用的輻射劑量。

　　3.細胞復蘇與凍存

　　細胞復蘇是指將凍存的細胞解凍之后再重新培養，細胞從冷凍停止生長狀態恢復生長的過程。復蘇過程如下圖所示：

　　Q：細胞復蘇后，為什么很多難以貼壁？

　　A：忽略培養基的問題，主要考慮細胞凍存時狀態差或者復蘇時動作太慢導致細胞死亡。切記最重要的融化速度要快，可不時搖動冷凍管，使之盡快通過最易受損的溫度段（-5～0℃）。

　　細胞凍存則是將細胞放在低溫（-70℃~196℃）環境，降低細胞內的代謝活動，最大限度的保存細胞活力，以便長期存儲。

　　Q：目前細胞凍存液多采用的什么配方？

　　A：目前細胞凍存多采用DMSO二甲基亞砜或甘油作保護劑，細胞凍存液的配方有很多種，如培養基：血清：DMSO=7:2:1或8：1：1或5：4：1，或直接用血清：DMSO=9:1，一般高濃度血清有助于維護細胞活力，復蘇存活率在80%～90%以上。

　　4.細胞的傳代培養

　　細胞在培養過程中不斷增殖，培養皿空間有限，細胞過密生長就會受到抑制，影響細胞的狀態，因此我們要把細胞中的一部分分到別的培養皿里，這樣細胞才能生長的好。

　　Q：細胞傳代培養為什么要選擇對數期細胞？

　　A: 細胞的生長和分裂，一般遵循以下模式：停滯期，對數期（指數期），平穩期（平臺期）和衰退期。為了確保活力，遺傳穩定性和表型穩定，必須使細胞保持在對數期。一般細胞長到70%~80%左右就可以傳代了。

　　除了上述幾個環節的關節問題外，細胞培養還有很多小問題如下：

　　Q：培養基多久換一次？

　　A: 正常情況下，培養液偏紅色。如果細胞維持在pH6.5～6.6條件下，培養基變黃，說明培養液中代謝產物已堆積到一定量，細胞會脫落死亡，需要更換新鮮培養液。一般細胞生長旺盛時1～2天換一次，生長緩慢時，3～4天亦可。針對復蘇后的細胞，建議隔天換液。

　　Q：血清應如何融解？

　　A：從冰箱中取出血清，放于2-8℃融化，融化過程中不時旋轉（swirling mix）混勻。充分融解后分裝或平衡到室溫后使用。

　　Q：如果細胞形態不清晰或有異物等，如何處理？

　　A：可以考慮如下操作：首先，倒掉舊的培養基，用新的培養基或者PBS洗滌2-3次，再開始正式的消化、吹打。其次，把吹打下來的細胞懸液加入到新的培養瓶內。后續再密切觀察。

　　Q：血清中出現絮狀沉淀是否需要去除？如何去除？

　　A：多種原因可能導致絮狀沉淀的形成，最常見的原因之一是融化過程中，脂蛋白聚集所致。該現象一般不會影響產品質量。可以400g離心5分鐘，取上清，然后過濾。根據需要選擇合適的濾膜孔徑，一般最常用的是0.22um PES材質的濾膜。為避免濾膜阻塞，建議離心后取上清加入培養基內一起過濾而不是直接過濾血清。

　　總之，細胞培養是后續實驗的基石，留心各種細節問題，嚴守滅菌處理的程序，保護好自己養的細胞，這樣才能快樂地進行后續的實驗。