細胞培養注意事項（入門級）

　　總的原則：無菌操作、保證細胞培養環境的穩定性

　　按時間順序整理

　　1、 細胞房和生物安全柜（或超凈工作臺）先開紫外照射30min。作用：對環境滅菌（空氣）。（備注：如果著急，至少也要開15分鐘）

　　在做實驗之前考慮好需要哪些物品。開始照射之前，將所需要用到的物品都放到生物安全柜（或超凈工作臺）里面。

　　常用移液槍或電動移液器等，需要在工作臺上放置一套專用設備。

　　細胞培養箱一般都已經調整好。定期留意一下二氧化碳是否足夠。不夠及時更換。

　　2、 顯微鏡需要定期消毒酒精擦拭。注意：顯微鏡一般都放在細胞房。

　　3、 進入實驗之前，首先給自己帶上拖鞋、頭套，口罩，實驗服，手套（手套帶雙層）。注意：手套要將袖口套進去。實驗服、拖鞋最好是細胞房專用。

　　4、 開始操作之前先觀察細胞。

　　首先觀察細胞培養液的顏色。現在的細胞培養液通常都放有酸堿指示劑（絕大部分是酚紅）。細胞在培養生長過程中，不斷在培養液上清中累積酸性物質，時間長了，培養液變為黃色（同時培養液中營養物質耗盡）。

　　其次鏡下觀察細胞的生長狀態是否良好，是否需要傳代。如果生長狀態不好，需要對培養液進行調整（一般是加大血清濃度）。過于密集出現大片融合或太密集而導致細胞脫落，則進行傳代。

　　如果長勢良好，且細胞培養液顏色未發生變化，可以酌情進行1/2、 1/3、1/4換液，也可以全換液。總之，視細胞生長情況而定。

　　5、 細胞培養預準備：

　　首先是準備各種溶液。

　　第一是配制溶液過程中要用到的水。水用純水，高壓滅菌之后，再去內毒素。去內毒素方法很多，最簡單可以放在烘箱180度3小時。或者過去內毒素的柱子后，高壓滅菌。

　　第二，各種溶液滅菌：

　　抗生素用去內毒素水配制后，直接過濾除菌（過0.22u濾頭）。可以用一次性無菌注射器過一次性0.22u濾頭。

　　現在用的培養液，如果是商業化液體培養基，不用處理。如果是粉末，需要用去內毒素水在生物安全柜（或超凈工作臺）進行配制，再過濾除菌。可以先配濃縮液（如10×），過濾除菌后。再用滅菌去內毒素水稀釋成1×培養液。

　　第三，完全培養液的配制：

　　培養液加上合適比例的血清即可。但血清一般保存于－20℃，一般解凍是放在4℃冰箱解凍，耗時長，而且必須解決完全之后，才能進行完全培養基的配制。所以要提前幾個小時就將血清從－20℃轉入4℃，以期完全解凍。當然如果這一次就需要用完的話（是指用這些血清配制的培養液都用完），也可以放到37℃解凍。

　　第四，最重要的是保證過程中無菌。

　　液體必須要分裝。無論過程中用到的培養液、胰酶、血清、PBS、生理鹽水、抗生素盡量分裝。分裝是為了防止污染。如果操作有誤，僅能威脅到其中一支，而非整個。

　　培養液、血清、PBS、生理鹽水分裝為20mL、50mL或100mL/管

　　胰酶、抗生素可分裝為1mL/管。

　　分裝最好先于細胞操作

　　第五，操作之前，培養液先放到37度的細胞培養箱里復溫。原因：盡量減少對細胞的刺激。低溫對于細胞也是一個刺激因素。

　　第六，操作之前，大腦先過一遍此次操作所需要用到的所有用具。將所有用具先放到無菌臺面上。減少拿入拿出的動作，保證無菌。（如果萬一發現少拿了什么，也不要緊，再加上就是。如果是槍頭盒、移液管等用具，最好先用消毒酒精噴一下）。

　　第七，操作之前，帶著的手套先噴消毒酒精。然后再進入工作臺。等一分鐘，等手套上的酒精揮發之后再進行操作。

　　6、 細胞培養操作過程：

　　注意無菌。無論哪一管液體，開蓋后盡量立即關上（如果有幾瓶都需要開的，也注意，可以虛蓋）。蓋子向上放。操作時不要從開蓋的容器上方經過。另外，無菌臺面上擺放的各種東西，最好是一字擺開，平行于自己。盡量不要前后重疊。

　　細胞操作中所用的所有耗材試劑最好都是細胞培養專用。一般都以一次性耗材居多。1ML槍頭為加長型專用培養槍頭。移液管亦有專用10mL一次性無菌移液管

　　（1）細胞換液：

　　培養皿/瓶用槍頭或移液管吸去原培養液，加入新培養液。

　　（2）細胞傳代：

　　傳代之前先觀察，細胞是否密集，是否開始融合。一般融合達到70－80%就可以傳代。早點傳代也可以。

　　如果是貼壁生長的細胞：

　　1） 培養皿/瓶用槍頭或移液管吸去原培養液；

　　2） 無菌PBS或無菌生理鹽水洗滌3次（按培養體積加入）；

　　3） 加入適量胰酶消化適當時間（一般胰酶為0.25%；9cm/10cm培養皿和25cm培養瓶，一次加入1mL胰酶。消化時間視細胞類型等多種情況綜合考慮，一般如果是細胞株，非原代培養，消化1－2分鐘足矣）；

　　4） 用槍頭吹打數十次（視細胞類型而定。一般細胞株30－50次吧，耗時一般2分鐘左右）；

　　5） 加入適量體積完全培養基終止胰酶消化（如果是9cm/10cm培養皿和25cm培養瓶，可以加入1mL完全培養基；現在培養瓶（皿）里有2mL溶液）。

　　6） 現在可以將溶液進行分瓶（2mL）。如果是細胞株，直接均分到兩個培養瓶（皿）里。如果是原代培養，可以根據消化時間來對細胞進行分離；因此可以將溶液（2mL）都轉入新的培養瓶（皿）。

　　7） 將兩個培養瓶（皿）補足完全培養基到正常體積（果是9cm/10cm培養皿和25cm培養瓶，為5mL完全培養液）

　　8） 鏡下觀察。剛剛傳代細胞還沒貼壁，懸浮在溶液中，呈圓形。一般2h之內會貼壁，如果已經貼壁，根據細胞類型有不同的形態，但通常都不是圓形。

　　9） 鏡下觀察無誤之后，再放入細胞培養箱。培養瓶（皿）放入之前，可以用消毒酒精先擦一下。

　　10） 傳代之后，最好第二天細胞換液一次。當然，也可以視情況而定。

　　7、 收拾工作臺。物品歸位，倒出垃圾。再開紫外照射30min

　　8、 其它注意事項：

　　第一，經常觀察。最好是每天都顯微鏡下看一看，確定細胞狀態。然后該換液換，該傳代傳，不用理會的就原樣放回去。如果好幾天都不想理會，可以放不完全培養基，或者低血清濃度的培養液，維持細胞生存，但不增殖。

　　第二，是否加抗生素。這個視情況而定。細胞培養過程中，是要求盡量少添加不相關的雜質。抗生素對于細胞來說，也是一種負擔。但如果環境比較污染，直接添加好了。好比沒病不用吃藥，感冒了還是要吃藥；嬰兒沒病但還是要打疫苗。

　　第三，胎牛血清的解凍。血清一般保存于－20℃，要放在4℃冰箱解凍，耗時長，500mL要好幾個小時，我們經常是頭天離開實驗室之前放到4℃冰箱，過夜。所以經常分裝成10mL或者20mL。這樣，上午放到4℃冰箱，下午就可以用了。

　　第二，是否一定要細胞房。以及是否要完全嚴格的遵守種種器具專用。這個吧，見仁見智。凡所有種種措施及設備都是為了保證培養操作過程中無菌，減少感染的機率；專用試劑耗材保證無菌無內毒素。細胞房也是這么一個措施而已，其它試劑耗材也是；我們沒有專門的細胞房也這么養。

　　并不是說走夜路就一定會遇到鬼，當然走多了遲早遇到，如果總是遇不到，這個人運氣一定很好——可以去買彩票。

　　剛開始我們實驗室也是沒有專用的生物安全柜和細胞房，拖鞋什么的也沒辦法專用，沒有加抗生素，照樣養得好好的。但是，交叉養，還是需要注意，一是時間上分隔開來：每天細胞培養先操作。其它細菌之類操作靠后，且操作后消毒酒精臺面消毒，紫外照射1小時。二是其它操作要小心，避免帶入污染。當然，如果有必要加抗生素，還是盡早加，比細胞污染了再去搶救要來得好。