細胞外囊泡（細胞微粒、外泌體）檢測（一）

細胞外囊泡

細胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是指從細胞膜上脫落或者由細胞分泌的雙層膜結構的囊泡狀小體，直徑從40nm到1000nm不等。胞外囊泡主要由微囊泡（Microvesicles,  MVs）和外泌體（Exosomes, Exs）組成，微囊泡是細胞激活、損傷或凋亡后從細胞膜脫落的小囊泡，直徑約為100nm – 1000nm；

外泌體由細胞內的多泡小體（multivesicular bodies）與細胞膜融合后以外分泌的形式釋放到細胞外，直徑約為40nm - 100nm。細胞外囊泡廣泛存在于細胞培養上清以及各種體液（血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁）中，攜帶有細胞來源相關的多種蛋白質、脂類、DNA、mRNA、miRNA等，參與細胞間通訊、細胞遷移、血管新生和免疫調節等過程。在糖尿病、心血管疾病、艾滋病、慢性炎癥疾病以及癌癥中都發現細胞外囊泡水平的升高，它們很有可能成為這類疾病的診斷標志物，因此，對細胞外囊泡進行準確的定性和定量研究顯得尤為重要。
 
細胞外囊泡的檢測方法

目前細胞外囊泡（EVs）的檢測方法主要有掃描電子顯微鏡、原子力顯微鏡、動態光散射技術、納米微粒追蹤分析術（NTA）、流式細胞儀和ELISA等，由于通量高、用時短、操作簡單，ELISA和流式細胞儀是比較常用的方法。ELISA方法容易受其他可溶性抗原的干擾，而且無法知道囊泡的大小、數量等信息；流式細胞儀不僅可以檢測囊泡的大小、數量，而且通過細胞特異的標記物染色可以檢測囊泡的來源，將囊泡進行分類，因此，流式細胞儀理論上是進行囊泡快速、高通量、多參數檢測的最優選擇。然而，傳統流式細胞儀針對的樣本主要是細胞，散射光的檢測極限通常是300-500nm，而大多數細胞外囊泡的直徑都在300nm以下，由于無法與背景噪音區分，直徑小于300nm的細胞外囊泡很難被檢測到，因此，囊泡數量往往被低估，檢測結果自然也不準確[1]。

Apogee流式細胞儀的三大優勢

（1）最靈敏的散射光分辨率

英國Apogee公司的A50-Micro突破傳統流式細胞儀的檢測極限，優化的光學模塊和優異的散射光檢測能力使得A50-Micro具有無法匹敵的靈敏度（<100nm）和最好的光散射分辨率（10nm）。圖1展示的是A50-Micro與傳統流式細胞儀（F500）及一些新型流式細胞儀（Gallios、Influx）的技術對比[1]，通過前向角散射光FC500只能勉強區分0.5μm和0.9μm的微珠，0.5μm以下的微珠則完全無法區分；Gallios和Influx在散射光檢測能力方面有所提高，可以區分0.3μm和0.5μm的微珠，但0.3μm以下的微珠還是無法區分；而Apogee A50-Micro可以輕松地將0.14μm的微珠和0.3μm的微珠分成兩個群（Fig 1.A）。從前向角散射光和側向角散射光的散點圖中可以看到，無論是FC500還是Gallios或Influx都只能部分的將0.3μm的微珠與背景噪音區分開，而A50-Micro可以清晰地將0.3μm的微珠與背景噪音完全區分開（Fig1.B中綠色數據點），并且只有A50-Micro可以檢測到0.14μm的微珠（Fig1.B中紫色數據點）。這些結果說明，利用Apogee A50-Micro突出的高靈敏度和分辨率，我們可以輕松地將直徑相差10nm以上的細胞外囊泡樣本進行分群、計數、分析。另外，多達9通道熒光檢測器，可以靈活使用細胞外囊泡特定抗原熒光抗體進行囊泡來源、數量的精確分析。Apogee A50-Micro是市場上唯一能夠通過散射光檢測小至100nm小顆粒的流式細胞儀，在細胞外囊泡的檢測上優于任何一個競爭對手。

Figure 1. Technological improvement in forward scatter (FS) for microparticle (MP) measurement: (A) Beads resolution improvement: FS distribution of a blend of fluorescent latex beads (0.1/0.14, 0.3, 0.5 and 0.9 μm) with a threshold on fluorescence. (B) Background noise reduction: Scatters dot plot showing blue (0.9 μm beads), red (0.5 μm beads), green (0.3 μm beads) and violet (0.1/0.14 μm beads) beads with a FS threshold. Grey dots are background noise.