美國FDA關于提交抗病毒藥物二代測序數據要求概述

　　2019年7月，美國食品藥品監督管理局（FDA）發布了關于抗病毒藥物產品提交二代測序數據的指南。指南為抗病毒藥物產品向FDA提交二代核苷酸序列分析程序以及支持耐藥性評估數據提供了意見。

　　一、背景信息

　　為保護公共衛生、避免出現可能傳染他人并導致不能通過已批準藥物產品控制疾病暴發的新型耐藥和交叉耐藥病毒變異體，提供準確的耐藥性信息勢在必行。

　　FDA對開發中的抗病毒藥物產品相關的耐藥性數據進行獨立分析，從而確保在新審批的抗病毒藥物產品說明書中對產品耐藥性進行表征分析和解釋。此外，FDA要求將宿主靶向基因的核苷酸序列分析數據用于多態性分析，以此確定基于不同種群的等位基因是否對療效有影響。

　　二、二代數據提交要求

　　FDA要求申請人應當提交詳細的方案來描述樣本處理和二代測序技術（NGS）分析程序。同時每個研究的數據應提供基于種群測序、適合分析的病毒耐藥性數據格式，顯示基線和無效序列，并在氨基酸與參考序列相同時使用空白細胞。FDA建議申請人在與FDA協商后，建立耐藥性數據集的靈敏度水平，或者提供選擇靈敏度水平的理由。提供顯示每個研究或研究亞組（例如各基因型、各劑量）的主要替換的高水平匯總的表格。

　　申請人應當提供：（1）頻率表來報告所有頻率大于或等于1%的與基線不同的氨基酸替換。（2）以fastq格式提供每次序列運行中的所有原始NGS數據，拼接的序列比對可以選擇以“.fas”“.ace”“ .sam”或“.bam”格式提交。（3）適當的參考序列以及用于任何參考比對的信息。（4）基線或參考共有序列并陳述該序列是如何得出的。（5）對于從頭拼接，以fastq格式提供所有大于200個核苷酸的重疊群。

　　三、NGS檢測要求

　　NGS方案中包含以下通用方案設計元素：（1）受試者、研究時間點和待分析的樣本矩陣的描述；（2）待使用的NGS平臺的描述，包括所有相關的性能特征；（3）待分析的目標基因區域名稱和大小；（4）通用分析策略（例如：鑒別相對于原型株的改變，比較同一受試者不同時間點的序列）；（5）檢測的覆蓋水平，對于一些病毒載量較低的樣本可能不能在滿足要求的覆蓋水平下產生拼接，申請人應當鑒別不能達到該覆蓋水平的樣本；（6）用于鑒別、過濾或處理測序錯誤的方法描述。

　　獲得可靠測序結果的關鍵是模板制備，因此待測序的樣本代表了正在分析的種群，應對以下信息進行描述：從樣本中提取核酸的方法；從污染背景核酸中純化病毒序列的方法；濃縮病毒核酸的方法，包括每個樣本用于逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）（病毒RNA）或PCR（病毒DNA）反應的估算目標拷貝數；變性次級結構的方法；生成雙鏈DNA（dsDNA）的方法（包括引物的描述、純化dsDNA用于測序的方法）；NGS文庫制備的方法等。

　　四、NGS數據分析方法和報告要求

　　序列數據的提交必須包括對用于分析測序數據集和原始序列信息分析流程的全面描述，這樣FDA才能進行獨立的數據分析。報告應當包括（1）每個序列運行測序的序列總數，測序序列的質量評分，測序序列的平均長度，為降低平臺特異性誤差影響而進行的任何誤差評估的描述，以及有關采用了何種修飾參數來清除潛在序列誤差或者去除未能滿足任何質量或長度閾值的測序序列的信息。（2）用于向關注序列中添加條形碼序列的方法描述，用于根據條形碼將測序序列分類的程序，條形碼序列是如何從序列修飾的描述，以及所采取的任何消除潛在交叉條形碼污染的預防措施的描述。

　　NGS數據分析可采用兩種方法來支持抗病毒藥物產品的開發：（1）短測序序列與參考序列比對。（2）短測序序列從頭拼接來組裝重疊群。比對測序序列與參考序列并識別變異體。根據序列比對和變異體識別報告結果。

　　五、NGS文件類型和提交程序

　　Fastq格式的原始NGS數據和頻率表應當按照技術規范文檔《采用eCTD傳遞電子申請規格》中列出的指南，通過安全便攜式硬盤發送至FDA。便攜式硬盤的內容應注意：（1）硬盤僅可提交原始NGS數據、頻率表和目錄；（2）所有NGS數據均應當以fastq格式提供，其中包括核苷酸序列和質量信息；（3）各個時間點每例受試者的NGS序列運行，包括基線和接近觀察到治療失敗的時間點；（5）申請人提供的fastq文件應當標記有唯一的受試者識別碼和時間點；（6）NGS方案、適合分析的耐藥性數據集以及任何其他支持信息均應當通過CDER電子文件途徑提交。

　　六、結語

　　NGS是一種新興技術，申請人在進行基于序列的耐藥性分析時頻繁采用該項技術。由于該技術可生成臨床樣本中所有RNA或DNA的核苷酸序列，故NGS檢測在有效區分病原體變異體的同時，也增加了耐藥性分析過程的復雜性。與Sanger核苷酸序列分析相比， NGS可提供一個病毒種群中個體病毒的核苷酸序列信息，通常每個樣本能提供數以百萬計或數以億計的短序列。由于目前尚無標準化的生物信息分析方法來分析這些大型數據集，數據的復雜性為審評員分析和驗證序列信息帶來了挑戰。目前，器審中心尚未收到該類產品的注冊申報，FDA關于抗病毒藥物產品提交二代測序數據的要求為器審中心將來對同類檢測產品進行技術審評起到借鑒作用。

　　參考文獻：

　　[1] FDA.Submitting Next GenerationSequencing Data to the Division ofAntiviral Products