脂肪組織和細胞的總蛋白提取

脂肪組織特別是白色脂肪組織（WAT）已經被證實除了具有能量儲存功能外，還與內分泌和器官炎癥有關。從脂肪組織中提取和分析蛋白質對于了解許多生理 / 病理狀態越來越重要。但是由于白色脂肪組織（WAT）和棕色脂肪組織（BAT）中高脂肪和低蛋白含量，所以在技術上極具挑戰性。

眾所周知目前生物樣品中水油乳化物最難分離，具有獨特表面性質的帶孔徑的離心管柱和優化的無表面活性劑的緩沖液系統，可以快速有效的從脂肪組織勻漿中將水油乳化物分離。提取緩沖液比脂肪組織中的油冰點低，脂肪組織勻漿通過離心管柱能將水相和油相迅速分開，組織中的總蛋白無丟失。蛋白質得率可達 2-3 mg/ml，遠遠高于其他方法。

柱式法 Minute TM 脂肪組織和細胞的總蛋白提取操作步驟：

從脂肪組織中提取蛋白（白色脂肪組織或棕色脂肪組織）

1. 將緩沖液 A，離心管柱和接收管套管放置于冰上預冷。

2. 秤取 50-80 mg 新鮮或冷凍脂肪組織，把它放在幾層紙巾上，用拇指和食指擠壓，從組織中去除一部分油。用鑷子將組織放入試劑盒提供的 1.5 ml 離心管中，秤取 100 mg 蛋白提取粉加入樣品中。加入 50 ul 緩沖液 A。

3. 用研磨棒扭轉研磨組織樣品 1-2 分鐘成漿狀。再加入 200-300 ul 緩沖液 A，繼續研磨樣品 30 秒鐘。如果起始組織量較小（20-40 mg）需要加入 100-150 ul 緩沖液 A。

4. 蓋上蓋子，2000 rpm 離心 1 分鐘。將上清液轉移到放置在接收管里的離心管柱中（研磨棒可以重復使用，用酒精擦拭清潔，空氣干燥）。

5. 在 - 20℃，開蓋孵育 15-20 分鐘。（請確保冰箱溫度在 - 20℃附近，否則參照下面的常見問題）

6. 孵育后立刻在 2000 rpm，開蓋離心 1-2 分鐘。棄去離心管柱，所得為脂肪組織中的總蛋白。提取出的蛋白中含有少量不溶物為非水溶性細胞組分。可以將其稀釋后直接用于 ELISA 檢測水溶性蛋白。也可以用緩沖液 B 或 C 重懸溶解非水溶性蛋白用于下游應用：

A. 在提取出的蛋白溶液中加入 1/10 緩沖液 B 成為變性蛋白溶液（用于 SDS-PAGE，Western 和其他應用）或者

B. 在提取出的蛋白溶液中加入 1/10 緩沖液 C 成為非變性蛋白溶液（用于 IP，ELISA 和其他應用）或者

C. 用 2X 的 2D 膠樣品緩沖液溶解用于 2D 分析。

注意：緩沖液 A 中含有可能會感染質譜分析的組分。如果提取的蛋白用于質譜分析，在提取前需透析緩沖液，或者用 TCA 法沉淀蛋白。

從脂肪細胞中提取蛋白

1. 低速離心收集 50-100 million 脂肪細胞。在 1.5ml 離心管中加入 1ml 預冷的 PBS（可根據上述建議加入磷酸酶抑制劑或者蛋白酶抑制劑）重懸細胞。加入 100 mg 蛋白提取粉

2. 3000 rpm 離心 3 分鐘，棄去上清液。用研磨棒扭轉研磨 1-2 分鐘使細胞勻漿。加入 200-300 ul 緩沖液 A，繼續研磨 30 秒。

3. 2000 rpm 離心 1 分鐘，然后將上清液轉移到預冷的離心管柱接收管套管中。接轉以上步驟 5-6