血細胞常用的染色方法

血細胞常用的染色方法是檢驗技師需要了解的知識，醫學教育網搜索整理如下：

細胞涂片，在用普通光學顯微鏡觀察之前需要固定和染色。固定是將細胞蛋白質和多糖等成分迅速交聯凝固，以保持其原有結構不發生變化。染色的目的是使細胞的主要結構，如細胞質、細胞核、細胞器等染上不同的顏色，便于顯微鏡下觀察。各種細胞涂片，常用的染色方法有瑞氏（Wright）、姬姆薩（Giemsa）、巴氏（PaPanicolaou）和蘇木素一伊紅比emat0Xylineosin，HE）染色。

一、染料與染色

染料（dyes）是一種具有顏色的有機化合物，最早用于織物的著色。隨著生物醫學的不斷發展，顯微鏡技術的出現和逐步完善，科學家們用染料將生物組織細胞和病原體著色，以利在顯微鏡下觀察各種結構，這種染料稱為生物學染色劑（biologystains，BS），生物染色劑的發現和利用促進了醫學生物學的進一步發展。

（一）細胞學的基本染料

染料可分為兩大類，即天然染料和人工合成染料。生物染色劑多屬于后者。各種生物學染色劑都具有產生顏色和與被染組織親合兩種性質。這兩種性質主要由兩種特殊基團即發色基團（chromophoro）和助色基團（auxochrome）所產生。

所謂發色基團，是染料產生顏色標志的未飽和基團。不同的有機化合物可以吸收不同波長的光，如吸收可見光區以外的光，這些物質是無色的；如吸收可見光區內某些波長的光，這些物質是有色的，其肉眼可見的顏色為被吸收光顏色的互補色。一般飽和芳香族化合物很少有可見光區的吸收帶，因而無顏色可見。相反，如苯的衍生物則具有此吸收帶而呈現顏色。這些化合物顯示的吸收帶與不穩定價鍵（如π鍵）有關。對苯二酚是無色的，但氧化失去兩個氫原子時變為具黃色的對醌式結構，這種使有機化合物在可見光區內產生光吸收的基團稱為發色基團，常見的發色基團有烯基、炔基、羰基、偶氮基、亞硝基等。助色基團是一種能使化合物發生電離作用的輔助原子團，能與發色基團構成更完整的共軛體系，使分子激發能進一步降低，染料的色澤加深并使其與被染組織更具親合力，染料的助色基團是使染料成為鹽類的部分，助色基團的性質決定染料在水溶液中的荷電性，常見的助色基團有羥基、竣基、氨基等。根據助色基團的性質，將生物學染色劑分成堿性染料和酸性染料兩大類，即能接受質子者為堿性染料，能釋放質子者為酸性染料。

1、堿性染料（basicdyes） 屬苯胺類藍色染料，如噻嗪（thiazins）系列，包括亞甲藍（methyleneblue）、天青A（azure A）、天青B（azureB）、天青C（azureC）和硫堇（thionine），它們的區別在于結合甲基的數量。以天青B為例，它含有兩個發色基團，一個次氨基（－N一）和一個鄰醌式基團。助色基團為氨基（一NH2），結合一個質子后荷正電，亦稱陽離子染料。因此，這些染料與細胞內的酸性成分，如DNA、RNA、特異的中性顆粒基質、某些胞漿蛋白等結合，主要是染細胞核的染料。還有一個很重要染核染料是蘇木（hematoxyline），屬媒染料（mordantdyes），需媒染劑（如Al3+）參與才能使細胞核著色。

2、酸性染料（aciddyes） 細胞學較重要的酸性染料有兩大類，即熒烷一氧雜蒽染料（horane－xanthenedyes）和偶氮染料（azodyes）。前者是一類以氧雜蒽和醌式苯環作為發色基團，以羧基（－COOH）為助色基團的染料，因為羧基能提供一個質子，亦稱“陰離子染料”。這類染料的代表是伊紅Y（eosinY，俗稱黃色伊紅）和伊紅B（eosinB，俗稱藍色伊紅）。這兩種染料特別適于與噻嗪類染料（亞甲藍，天青B等）作對比染色，形成紅藍分明、色澤艷麗的結果，因為伊紅具較強的擴散吸附染色特性。酸性偶氮類染料有橙黃G（orangeG）、剛果紅（congored）、亮藏花精（brilliantcrocein）等。由于酸性染料是陰離子型染料，因此它們與細胞中的堿性成分結合并染色，如血紅蛋白、嗜酸性顆粒成分及胞漿中的一些蛋白質。

除上述酸性和堿性染料外，有的還將在同一條件下既具陰離子型又有陽離子型的染色劑稱復合染料，如瑞氏染色劑、姬姆薩染色劑等。

（二）染色原理

細胞著色的原理至今雖無滿意的解釋，但多數學者認為是物理作用和化學作用綜合的結果。

1、物理作用

包括毛細管現象和滲透、吸收、吸附作用等。通過這些因素，染料的色素粒子就能順利地進入組織、細胞并與其牢固結合而著色。

瑞氏染色法

Wrfeht和Giemsa都于1902年報告了各自的新的血液學染色劑，其主要特點是在制備多色性亞甲藍（主要指天青B）方面做了改進，使血細胞和瘧原蟲著色較好，操作簡便。

上述染色法均是含伊紅和亞甲基藍衍生物的復合染料。在臨床檢驗工作中，瑞氏染色法常用于血液、其他體液、分泌物和排泄物涂片中各種細胞的染色，有利于在顯微鏡下觀察細胞形態及對細胞進行分類檢查。

【染色原理】

瑞氏染色分兩相進行，第一相是酸性染料伊紅與細胞中的堿性物質如血紅蛋白、嗜酸性顆粒等結合；堿性染料天青B與細胞中的酸性物質如核染色質（chro－matin）、特異中性顆粒、血小板及富含核蛋白的胞質結合。第二相是天青B和伊紅在適宜條件下形成紫色的天青B一伊紅復合物（azureB－eosincomplex），這種復合物是形成Romanowsky－Giemsa效應的基礎。

Romanowsky－Giemsa效應包括：①白細胞核染色質染成紫色，瘧原蟲的染色質染成紅色；②中性粒細胞的顆粒及血小板顆粒區染成紫色；③產生本效應必須有兩種染料參與，一種是天青B，另一種是伊紅。

Wittekind（1985）指出，天青B與DNA分子中的磷酸基結合，而伊紅既與DNA分子中的陽離子部位結合，又與天青B結合，與天青B的結合力來源于電子供一受體的電子轉移力，天青B的甲氨基（－NHCHs）與伊紅分子中的叛基（－COOH）間形成氫鍵。因此，天青B是噻嗪類染料中能與伊紅形成復合物的最佳選擇，因為擁有四個甲基側鏈的亞甲藍不能以氫鍵與伊紅結合。

甲醇除作為染料的溶劑，能將瑞氏染料解離成帶正電荷的天青B和帶負電荷伊紅外，因其具有脫水力，還可將細胞固定為一定形態，并使蛋白沉淀為顆粒狀、網狀結構，增加細胞與染料的接觸表面，增強染色效果。

細胞中的各種有機物質（特別是蛋白質）、染料等對環境的州值非常敏感。如環境偏酸，氫離子增多，降低對堿性染料的親和力；增強伊紅著色，出現異常紅染；相反，則可出現異常藍染。最佳環境應維持在PH值64～6、8.因此，必須使用緩沖溶液。

【試劑】

1、Wright染液 瑞氏染粉0.1g；甲醇60.0ml.

將瑞氏染料放入清潔干燥乳缽里，加少量甲醇，充分研磨使染料溶解，將已溶解的染料倒入棕色試劑瓶中，未溶解的再加少量甲醇研磨，直至染料溶完，甲醇全部用完為止。或將瑞氏染粉和甲醇直接置于棕色瓶中，加碎玻璃適量，立即用力振蕩smin，置室溫中，連續3天，每天振搖2～3次，促其溶解。配好后放室溫，一周后即可使用。新配染液效果差，放置時間越長天青B越多，染色效果越好。久置應密封，以免甲醇揮發或氧化成甲酸，甲醇需用AR級。上述量染液中也可加中性甘油3ml，除可防止染色中甲醇過早揮發外，并可使細胞著色清晰。

1、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH6.4～6.8）

磷酸二氫鉀（無水）0.3g；

磷酸氫二鈉（無水）0.2g；

蒸餾水加至1000ml.

配好后用磷酸鹽溶液校正pH，塞緊瓶口備用。

【染色方法】

（1）用蠟筆在血膜兩頭劃線，然后將血片平放在染色架上；

（2）加瑞氏染液數滴，覆蓋整個血膜，固定細胞約lmin；

（3）滴加等量或稍多的緩沖液，與染液充分混勻，染色5～10min；

（4）用清水沖去染液，待干后鏡檢。

【染色結果】在正常情況下，血膜外觀染成淡紫紅色。顯微鏡下，紅細胞呈粉紅色，在厚薄均勻處，略有碟狀感；白細胞漿中顆粒清楚，并顯示出各種細胞特有的色彩。細胞核染紫紅色，核染色質結構清楚。

染色偏酸，則紅細胞和嗜酸性粒細胞顆粒偏紅，白細胞核呈淡藍色或不著色。染色偏堿，則所有細胞呈灰藍色，顆粒深暗。嗜酸性顆粒可染成暗褐色，甚至紫黑或藍色。中性顆粒偏粗、偏堿，染成紫黑色，血膜厚的部位呈綠色。

【注意事項】

1、未干透血膜的不能立即染色，否則染色時易脫落。

2、染色時間，與染液濃度、室溫及細胞多少有關。梁液淡、室溫低、細胞多，則染色時間長；反之則可減少染色時間。染液濃淡及染色時間長短要摸索，特別是更換染液時更應如此。

3、染液不能過少，以防蒸發沉淀，一旦染液沉淀在血膜上，則不易沖掉。

4、沖洗時不能先倒掉染液，應以流水沖去，以防染料沉著在血膜上。沖洗染料時間不能過長，以防脫色。沖洗完的血片應立放于架上，防止剩余水分浸泡脫色。

5、如血膜上有染料顆粒沉積，可用甲醇溶解，但需立即用水沖掉甲醇，以免脫色。

6、染色過談，可以復染，復架時應先加緩沖液，創造良好染色環境，而后加染液，或加染液與緩沖液的混合液，不可先加染液。

7、染色過深可用水沖洗或浸泡一定時間，也可用甲醇脫色。

8、染色偏酸或偏堿時，均應更換緩沖液再重染。