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一、 組織和細胞總RNA提取：異硫氰酸胍法（一）試劑準備1．CSB緩沖液：42mM檸檬酸鈉；0.83% N-lauryl sarcosine(十二烷基，N甲基甘氨酸鈉)；0.2 mM β-巰基乙醇。2．變性液：異硫氰酸胍（終濃度 4 M）25g、CSB緩沖液 33ml，混合直至完全溶解，可在65℃助溶。4℃保存備用。3．2 M乙酸鈉：pH 4.0。4．異丙醇5．無水乙醇、70%乙醇6．酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）7．DEPC H2O：100ml ddH2O中，加入DEPC 0.1ml，棄分振蕩，37℃孵育過夜。15磅高壓滅茵，4℃保存備用。（二）操作步驟 1．樣品處理：（１）培養細胞：收集細胞1-2×107，離心，500g×5min。對于貼壁培養細胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化后，PBS重懸細胞并轉移至10ml離心管中；懸浮培養細胞可直接轉移離心管；離心：500g×5min；PBS洗滌......閱讀全文
RT-PCR實驗有三步：抽提RNA，RT，PCR。 要求：1.做RT前必需測RNA濃度，逆轉錄體系對RNA量還是有一些要求，常用500ng或1ug。2. RT按要求做，一般不會出太大問題。 3. PCR，按常規。但如需擴長片段，則對前兩步要求較高，需要有完整的cDNA存在，不是單
（一）一般光學顯微鏡術應用一般光學顯微鏡（簡稱光鏡）觀察組織切片是組織學研究的最基本方法。取動物或人體的新鮮組織塊，先用固定劑（fixative）固定（fixation），使組織中的蛋白質迅速凝固，防止細胞自溶和組織腐敗。常用的固定劑如灑精、甲醛、醋酸、苦味酸、四氧化鋨等，一般常將幾種固定劑配制成混
包括Northern雜交在內的許多分子生物學實驗均是以RNA為材料，mRNA的制備也需要一定質量的總RNA樣品，RNA的數量、純度與完整性將直接影響這些實驗的結果。RNA中rRNA的數量最多，占總量的80%～85%；tRNA及核內小分子RNA占15%～20%；mRNA僅占1%～5%。由于各種rRNA
一、核酸分子雜交技術1961年Hall開拓了液相核酸雜交技術的研究，其基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基順序，通過堿基對之間非共價鍵的形成，出現穩定的雙鏈區，形成雜交的雙鏈。自此以后，由于分子生物學技術的迅猛發展，特別是70年代末到80年代初，分子克隆、質粒和噬菌體DNA的構建成功，核酸自動
一、核酸分子雜交技術1961年Hall開拓了液相核酸雜交技術的研究，其基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基順序，通過堿基對之間非共價鍵的形成，出現穩定的雙鏈區，形成雜交的雙鏈。自此以后，由于分子生物學技術的迅猛發展，特別是70年代末到80年代初，分子克隆、質粒和噬菌體DNA的構建成功，核酸自動
microRNA的實時定量莖環RT-PCR技術 摘要： 已開發出一種新型的microRNA（miRNA）的定量方法，即利用莖環反轉錄，Taqman PCR分析。莖環RT引物在RT 效率和特異性方面比傳統的更好。TaqMan miRNA的檢測是很具體的，可以檢測成熟miRNA和區分
1．RNA的提取 RNA的提取其實原理很簡單：通過變性劑破碎細胞或者組織，然后經過氯仿等有機溶劑抽提RNA，再經過沉淀，洗滌，晾干，zui后溶解。但是由于RNA酶無處不在，隨時可能將RNA降解，所以實驗中有很多地方需要注意，稍有疏忽就會前功盡棄。 1．1分離高質量RNA 成功的cDNA合成來
（一）實驗程序如不謹慎操作，外源性RNA酶可以通過下述途徑污染RNA制品：（１）玻璃制品、塑料制品和電泳槽 滅菌的一次性使用的塑料制品基本上無RNA〈, /SPAN〉酶，可以不經預處理直接用于制備和貯存RNA。實驗室用的普通玻璃器皿和塑料制品經常有RNA酶法染，使用前必須于180℃干烤８小時或更
核酸分子雜交技術由于核酸分子雜交的高度特異性及檢測方法的靈敏性，它已成為分子生物學中最常用的基本技術，被廣泛應用于基因克隆的篩選，酶切圖譜的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突變的檢測等。其基本原理是具有一定同源性的原條核酸單鏈在一定的條件下（適宜的溫室度及離子強度等）可按堿基互補原成雙鏈。雜交的
PCR的用途及使用方法真核生物的基因組是DNA，為什么不直接從DNA PCR得到我們需要的基因呢？因為真核生物的基因含有大量的非編碼區，稱為內元（intron），真正編碼蛋白的區段是被這些內元隔開的，這些編碼區叫做外元（exon）。真核生物的DNA轉錄成為RNA之后，經過剪切和拼接，去掉
真核生物的基因組是DNA，為什么不直接從DNA PCR得到我們需要的基因呢？因為真核生物的基因含有大量的非編碼區，稱為內元（intron），真正編碼蛋白的區段是被這些內元隔開的，這些編碼區叫做外元（exon）。真核生物的DNA轉錄成為RNA之后，經過剪切和拼接，去掉這些非編碼區，才形成成熟
在做Northern等雜交實驗、構建cDNA文庫、獲取能夠編碼真核生物蛋白的基因、獲得RNA病毒基因時，會用到RNA提取和RT-PCR技術。真核生物的基因組是DNA，為什么不直接從DNA PCR得到我們需要的基因呢？因為真核生物的基因含有大量的非編碼區，稱為內元（intron），真正編碼蛋白的區段是
PCR儀的用途及使用方法真核生物的基因組是DNA，為什么不直接從DNA PCR得到我們需要的基因呢？因為真核生物的基因含有大量的非編碼區，稱為內元（intron），真正編碼蛋白的區段是被這些內元隔開的，這些編碼區叫做外元（exon）。真核生物的DNA轉錄成為RNA之后，經過剪切和拼接，去掉這些非編碼
【原理】RNA的制備與分析對于了解基因表達在轉錄水平上的調節是必不可少的,也是最常使用的通過cDNA途徑分析細胞基因表達的前提。通常一個典型的哺乳動物細胞約含10-5μg RNA，但其中大部分為rRNA及由tRNA，而mRNA僅占1%～5%。雖然mRNA大小和序列各不相同，但在多數真核細胞m
1、塑料制品、玻璃和金屬物品的處理(a)塑料制品：盡可能使用無菌，一次性塑料制品。已標明RNase-Free 的塑料制品，如沒有開封使用過，通常沒有必要再次處理。對于國產塑料制品，原則上都必須處理方可使用。處理方法如下：(1)在玻璃燒杯中注入去離子水，加入DEPC使DEPC的終濃度為0.1%。注意：
在做Northern等雜交實驗、構建cDNA文庫、獲取能夠編碼真核生物蛋白的基因、獲得RNA病毒基因時，會用到RNA提取和RT-PCR技術。 真核生物的基因組是DNA，為什么不直接從DNA PCR得到我們需要的基因呢？因為真核生物的基因含有大量的非編碼區，稱為內元（intron），真正編碼蛋
來源于任何細胞的RNA都可以通過反轉錄酶的作用拷貝成雙鏈DNA并克隆化，獲得相應的于特定細胞來源的cDNA文庫。因此，RNA制備的意義有兩個方面* 獲得特定細胞來源的cDNA文庫，克隆目的基因* 分析基因的表達，闡明基因調控的特性，了解從基因轉錄產生RNA的結構，數量，水平及合成的速率抑制RNA酶活
【注意事項】基因組DNA分子量大，所有操作必須輕柔，酚/氯仿對皮膚有腐蝕作用，應該戴手套操作。二、RNA的制備【實驗目的】1.理解生物細胞中RNA制備方法的原理。2.熟悉組織細胞中RNA制備的基本操作。（一）細胞總RNA的提取1.異硫氰酸胍法【實驗原理】異硫氰酸胍法提取細胞總RNA是目前常用的提取方
1.在收獲組織及細胞死亡之后，應立即滅活內源的RNA酶，以防止RNA降解。以下3個方法均可有效使內源RNA酶失活：1）用含離液（如胍鹽）的細胞裂解液收獲樣品，并立即勻漿。2）用液氮瞬間凍結樣品。值得特別注意的是：組織塊必須保證足夠小，在浸入液氮的瞬間就能凍結，以確保瞬間令RNA酶失活3）立即將樣品置
RNAse的無處不在導致了RNA的脆弱敏感。要改善RNA提取的質量，專家為你介紹在RNA純化過程中要特別注意的10個問題。 在收獲組織及細胞死亡之后，應立即滅活內源的RNA酶，以防止RNA降解。以下3個方法均可有效使內源RNA酶失活：1）用含離液（如胍鹽）的細胞裂解液收獲樣品，并立即勻
一、顯微切割技術出現的背景 在分子病理學研究中，常常遇到兩個比較棘手的問題： 一是選取的研究材料需要在某一方面具有相同的特征，即具有一定程度的同質性。我們人體的各種組織絕大多數是由多種不同細胞組成的異質性的細胞群，這種選取同質性的研究材料問題在對人體組織的深入研究中常常遇到卻又不易解
一、顯微切割技術出現的背景 在分子病理學研究中，常常遇到兩個比較棘手的問題： 一是選取的研究材料需要在某一方面具有相同的特征，即具有一定程度的同質性。我們人體的各種組織絕大多數是由多種不同細胞組成的異質性的細胞群，這種選取同質性的研究材料問題在對人體組織的深入研究中常常遇到卻又不易解
【原理】RNA的制備與分析對于了解基因表達在轉錄水平上的調節是必不可少的，也是最常使用的通過cDNA途徑分析細胞基因表達的前提。通常一個典型的哺乳動物細胞約含10-5μg RNA，但其中大部分為rRNA及由tRNA，而mRNA僅占1%～5%。雖然mRNA大小和序列各不相同，但在多數真核細胞mRNA的
DNA重組技術（或基因工程）是20世紀生物學的偉大成就，并已滲透到生命科學包括醫學 各個領域，為腫瘤的實驗研究和臨床診斷及治療提供了嶄新的技術和有用的工具。本附錄扼要介紹在分子腫瘤學領域中常用的分子生物學基本技術及其在腫瘤研究中的應用，著重介紹它們的原理和應用。至于具體的技術方法和操作步驟可參閱《分
哺乳動物細胞總ＲＮＡ的分離細胞的裂解提取步驟注意事項 這一從培養的單層哺乳動物細胞中分離RNA的實驗程序系為Favaloro 等（1980）所介紹程序的改良。該程序同樣適用于從懸浮培養的哺乳動物細胞中或從易于分散成單個細胞的哺乳動物組織中分離RNA。但不適用于從固體組織中提取RNA，因為用這種裂解
多細胞測序和單細胞測序，你pick誰？如今，大多數研究人員也許會選擇后者，因為不一樣的角度，會帶來不一樣的見解。 多細胞測序和單細胞測序，你pick誰？如今，大多數研究人員也許會選擇后者，因為不一樣的角度，會帶來不一樣的見解。單細胞測序的最初動力來自癌癥研究，可幫助人們了解腫瘤異質性和腫瘤微環
為了獲得高質量的真核細胞mRNA， 必須使用RNA酶的抑制劑或采用下述的破碎細胞和滅活RNA酶同步進行的方法，最大限度地降低細胞破碎過程中所釋放的RNA酶的活性。同時，避免偶然引入實驗室內其他潛在的痕量RNA酶也很重要。下面列舉避免RNA酶法染問題的一些注意事項。大多數有經驗的研究者并不拘泥于這些注
為了獲得高質量的真核細胞mRNA， 必須使用RNA酶的抑制劑或采用下述的破碎細胞和滅活RNA酶同步進行的方法，最大限度地降低細胞破碎過程中所釋放的RNA酶的活性。同時，避免偶然引入實驗室內其他潛在的痕量RNA酶也很重要。下面列舉避免RNA酶法染問題的一些注意事項。大多數有經驗的研究者并不拘泥于這些注
一、核酸分子雜交技術1961年Hall開拓了液相核酸雜交技術的研究，其基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基順序，通過堿基對之間非共價鍵的形成，出現穩定的雙鏈區，形成雜交的雙鏈。自此以后，由于分子生物學技術的迅猛發展，特別是70年代末到80年代初，分子克隆、質粒和噬菌體DNA的構建成功，核酸自動
實驗概要本實驗介紹了從培養的單層哺乳動物細胞中分離RNA的實驗程序，該程序同樣適用于從懸浮培養的哺乳動物細胞中或從易于分散成單個細胞的哺乳動物組織中分離RNA。但不適用于從固體組織中提取RNA，因為用這種裂解細胞的方法（在SDS存在的條件下用蛋白酶K消化)去消化組織速度很慢，導致內源性RNA酶在被蛋