RNA提取與RTPCR(1)
在做Northern等雜交實驗、構建cDNA文庫、獲取能夠編碼真核生物蛋白的基因、獲得RNA病毒基因時，會用到RNA提取和RT-PCR技術。 真核生物的基因組是DNA，為什么不直接從DNA PCR得到我們需要的基因呢？因為真核生物的基因含有大量的非編碼區，稱為內元（intron），真正編碼蛋白的區段是被這些內元隔開的，這些編碼區叫做外元（exon）。真核生物的DNA轉錄成為RNA之后，經過剪切和拼接，去掉這些非編碼區，才形成成熟的mRNA，由mRNA再翻譯成蛋白質。 所以，如果直接從真核生物的基因組DNA獲取目的基因，克隆再表達，試圖獲取目的蛋白的思路是行不通的，因為獲取的DNA里面會含有非編碼區。要表達真核生物的基因并表達出相應的蛋白，只能通過提取其 mRNA并RT-PCR這條頗費周折的途徑。 1.RNA的提取 RNA的提取其實原理很簡單：通過變性劑破碎細胞或者組織，然后經過氯仿等有機溶劑抽提RNA，再經過......閱讀全文
RNA提取與RT-PCR(1)
在做Northern等雜交實驗、構建cDNA文庫、獲取能夠編碼真核生物蛋白的基因、獲得RNA病毒基因時，會用到RNA提取和RT-PCR技術。 真核生物的基因組是DNA，為什么不直接從DNA PCR得到我們需要的基因呢？因為真核生物的基因含有大量的非編碼區，稱為內元（intron），真正編碼蛋
RNA提取與RT-PCR
1．RNA的提取 RNA的提取其實原理很簡單：通過變性劑破碎細胞或者組織，然后經過氯仿等有機溶劑抽提RNA，再經過沉淀，洗滌，晾干，zui后溶解。但是由于RNA酶無處不在，隨時可能將RNA降解，所以實驗中有很多地方需要注意，稍有疏忽就會前功盡棄。 1．1分離高質量RNA 成功的cDNA合成來
RNA提取與RT-PCR(4)
2.8 小量RNA檢測方法的提高 當僅有小量RNA時，RT-PCR尤其具有挑戰性。在RNA分離過程中加入的作為載體的糖元有助于增加小量樣品的產量。可以在加入Trizol的同時加入無RNase的糖元。糖元是水溶性的，可以同RNA保持在水相中以輔助隨后的沉淀。對于小于50mg的組織或106個培養細胞
RNA提取與RT-PCR(2)
融解RNA一般使用TE。 保存RNA應該盡量低溫。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟、肝臟）中分離到的 RNA需要貯存在甲醛中以保存高質量的RNA，對于長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的 RNA，在水
RNA提取與RT-PCR(3)
2.3 RT-PCR的引物設計 RT-PCR引物設計和一般PCR引物設計可以遵循同樣的原則。細心地進行引物設計是PCR中最重要的一步。理想的引物對只同目的序列兩側的單一序列而非其他序列退火。設計糟糕的引物可能會同擴增其他的非目的序列。設計理想的引物都有以下共同的特點，而設計失敗的引物則各有各的缺
RT－PCR技術及RNA提取策略-1
第一部分 RNA 提取策略1、RNA降解的原因內源性RNAase是造成RNA降解的最重要原因，因為人體細胞自身就是幾十分鐘（20min？）mRNA被降解一輪，所以不管是組織還是細胞還是液體狀樣本在離開其中細胞的最佳生活狀態后都應該盡快的被妥善的方法保存起來。外源性RNA酶也是一個需要注意的因素，最常
RNA提取和RT-PCR
在做Northern等雜交實驗、構建cDNA文庫、獲取能夠編碼真核生物蛋白的基因、獲得RNA病毒基因時，會用到RNA提取和RT-PCR技術。真核生物的基因組是DNA，為什么不直接從DNA PCR得到我們需要的基因呢？因為真核生物的基因含有大量的非編碼區，稱為內元（intron），真正編碼蛋白的區段是
RNA提取和RT-PCR
真核生物的基因組是DNA，為什么不直接從DNA?PCR得到我們需要的基因呢？因為真核生物的基因含有大量的非編碼區，稱為內元（intron），真正編碼蛋白的區段是被這些內元隔開的，這些編碼區叫做外元（exon）。真核生物的DNA轉錄成為RNA之后，經過剪切和拼接，去掉這些非編碼區，才形成成熟的mRNA
總RNA提取與Northern雜交（1）
一、 總RNA的提取1、 取組織10-50毫克，剪切成大小在0.5厘米以內的碎片，加入×5的RNA later（約2毫升）。樣品在37度可保存1天。室溫下1周，4度下1個月。2、 勻漿：用Rnase Erase spray（ICN）清理勻漿器頭部（7mm），用DEPC水和乙醇清洗，將上述樣品用鑷
RNA 提取策略及RT－PCR技術
第一部分RNA 提取策略1、RNA降解的原因內源性RNAase是造成RNA降解的最重要原因，因為人體細胞自身就是幾十分鐘（20min？）mRNA被降解一輪，所以不管是組織還是細胞還是液體狀樣本在離開其中細胞的最佳生活狀態后都應該盡快的被妥善的方法保存起來。外源性RNA酶也是一個需要注意的因素，最常見
細胞RT-PCR的經驗(偏向RNA提取)
做RT也做了幾次,有成功也有失敗,在園子中受益良多,把我自已的一個流程放上來,供大家參考.細胞RT-PCR操作流程實驗流程一 、取RNA：1、 處理細胞：（1） 貼壁細胞：先用無菌DEPC水配制的PBS洗細胞兩次，棄盡PBS后，直接向培養瓶中加入1ml Trizol，通過溶解細胞，通過移液管分次移出
RT－PCR技術及RNA提取策略-2
一般的瓊脂糖凝膠電泳，注意不要用甲醛變性電泳（又不是做northern，實在沒有必要）。電泳槽注意一定不要用DEPC處理，一定要保證電泳體系中有少量的RNAase存在。分別在加樣孔中加入1，2，3μlRNA抽提溶液。在旁邊加入DNA marker。1%瓊脂糖凝膠，10V/cm的電壓，電泳10
RT－PCR技術及RNA提取策略-3
成功的RT PCR的要素1、高質量RNA 成功的cDNA合成來自高質量的RNA。高質量的RNA至少應保證全長并且不含逆轉錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。RNA的質量決定了你能夠轉錄到 cDNA上的序列信息量的最大值。一般不必使用oligo（dT）選擇性分離poly（A）+RNA。不管起始模
RNA提取與純化
實驗概要掌握RNA提取的基本技術，了解RNA提取過程中的各種注意事項。實驗原理RNA提取是分子生物學實驗中難度較大的實驗技術。?RNA提取和DNA提取有類似的地方，因為它們都是核酸，都具有較好的水溶性。提取RNA首先破碎細胞，然后用提取液將RNA溶出，反復抽提去除蛋白質，加入乙醇沉淀RNA，將RNA
線蟲總RNA提取及RT-PCR實驗方法
C. elegans RNA Isolation and RT-PCRReagents Needed:M9 (common stock)Trizol (stored at 4oC)chloroform2-propanol70% EtOHRNase-free H2OiScript cDNA Synth
核酸提取——RNA提取與DNA的提取
核酸分為兩大類：一類為核糖核酸（RNA），另一類為脫氧核糖核酸（DNA）。核酸的分子量極大，從數萬到億萬。核酸是兩性化合物，在一定的等電點溶于水，其水溶液呈酸性，不溶于乙醇等有機溶劑。細胞內的核酸常和蛋白質結合成核蛋白。核糖核蛋白和脫氧核糖核蛋白在不同濃度的電解質溶液中 的溶解度有顯著區別，在一定濃
核酸提取——RNA提取與DNA的提取
核酸分為兩大類：一類為核糖核酸（RNA），另一類為脫氧核糖核酸（DNA）。核酸的分子量極大，從數萬到億萬。核酸是兩性化合物，在一定的等電點溶于水，其水溶液呈酸性，不溶于乙醇等有機溶劑。細胞內的核酸常和蛋白質結合成核蛋白。核糖核蛋白和脫氧核糖核蛋白在不同濃度的電解質溶液中 的溶解度有顯著區別，在一定濃
酵母RNA提取與分離
一、目的：學習稀堿法提RNA的原理與技術。二、原理：由于RNA的來源和種類很多，因而提取制備方法也各異，一般有苯酚法、去污劑法和鹽酸胍法。其中苯酚法又是實驗室最常用的。組織勻漿用苯酚處理并離心后，RNA即溶于上層被酚飽和的水相中，DNA和蛋白質則留在酚層中，向水層加入乙醇后，RNA即以白色絮狀沉淀析
Northern雜交試驗指導手冊（1）－RNA提取
方法一、改良異硫氰酸胍提取法試劑及其配制異硫氰酸胍變性液：貯存液－在含484ml 水（經DEPC處理）, 17.6ml 0.75mol/L檸檬酸鈉（pH7.0）和26.4ml10%Sarkosyl的溶液中加入250g異硫氰酸胍，加熱至60~65℃并持續攪拌使之充分溶解。貯存液室溫保存備用（不超過3個
RNA提取心得（組織RNA提取和培養細胞的RNA提取）
一.組織RNA提取 1.最好新鮮組織，這樣RNA提取的效果比較好，這是肯定的。 2. 如果不是新鮮的（最好在半年之內，-80℃或者液氮中凍存的）組織，注意不要反復凍融，從冰凍狀態拿到0-4℃，注意不要拿到常溫，待組織解凍后，用 DEPC泡過的剪刀剪一小塊組織，稱重后，放到預冷的勻漿器中，然后
RNA提取
RNA提取（主要內容如下）Tips for Handing RNA?Total RNA IsolationmRNA IsolationrRNA IsolationOthersQ & A posted in the Method Forum??Basic Procedures for Handing
RT-PCR原理與實驗操作步驟-1
一、知識背景：1、基因表達：DNA RNA Protein單拷貝基因表達存在逐步放大機制，如一個蠶絲心蛋白基因 104個絲心蛋白mRNA（每個mRNA存活4d，可以合成105個絲心蛋白） 共合成109個絲心蛋白 。因此單拷貝基因的mRNA表達水平對于其功能水平的調控是非常重要的。2、PCR技術(ol
RT-PCR實驗方法大全(抽提RNA，RT，PCR)-1
RT-PCR實驗有三步：抽提RNA，RT，PCR。要求：1.做RT前必需測RNA濃度，逆轉錄體系對RNA量還是有一些要求，常用500ng或1ug。2. RT按要求做，一般不會出太大問題。3. PCR，按常規。但如需擴長片段，則對前兩步要求較高，需要有完整的cDNA存在，不是單改變Mg2+濃度、退火溫
總RNA提取與Northern雜交（2）
4、Loading buffer（10ul每個樣） ? 總體積 100ul 200 ul 500ul 10×MOPS
總RNA提取與Northern雜交（3）
第二天：將上述物品揭開，將膠正面朝下，膜正面朝上，用鉛筆作好標記。將膠浸泡在EB中1-2分鐘，用DEPC H2O清洗，將膜放在濾紙上面，夾好，4度下保存，或者直接進行預雜交。UV雜交（有助于RNA結合到膜上面）。五、預雜交和雜交預雜交和雜交 buffer： 100ul20×SSC 25ml （5×S
總RNA提取（Trizol提取）
在收集到生物材料之后，最好能即刻進行RNA 制備工作。若需暫時儲存，則應以液氮將生物材料急速冷凍后，儲存于-80℃冷凍柜。在制備RNA 時，將儲存于冷凍柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破細胞，不可以先行解凍，以避免RNase 的作用。1. 提取組織RNA 時，每50～100mg 組織用1ml
Rt-PCR實驗準備及與操作步驟-1
一、實驗器具與材料：1、移液槍：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl2、吸頭：1ml、200μl、20μl3、勻漿管：5ml4、吸頭臺：放置1ml吸頭的一個，放置20μl吸頭的一個5、EP 管：1.5ml、0.2ml、100μl6、試劑瓶：2個60ml的棕色試劑瓶（廣口，帶蓋）1個125m
真核細胞總RNA的提取與鑒定
【原理】RNA的制備與分析對于了解基因表達在轉錄水平上的調節是必不可少的，也是最常使用的通過cDNA途徑分析細胞基因表達的前提。通常一個典型的哺乳動物細胞約含10-5μg RNA，但其中大部分為rRNA及由tRNA，而mRNA僅占1%～5%。雖然mRNA大小和序列各不相同，但在多數真核細胞mRNA的
真核細胞總RNA的提取與鑒定
【原理】RNA的制備與分析對于了解基因表達在轉錄水平上的調節是必不可少的,也是最常使用的通過cDNA途徑分析細胞基因表達的前提。通常一個典型的哺乳動物細胞約含10-5μg RNA，但其中大部分為rRNA及由tRNA，而mRNA僅占1%～5%。雖然mRNA大小和序列各不相同，但在多數真核細胞m
植物總RNA的快速提取與純化
一、原理RNA包括rRNA、tRNA和mRNA等，大部分通常是以核蛋白復合物的形式存在的。通過SDS、苯酚處理使蛋白質變性并沉淀。利用LiCl溶解雙鏈DNA的特性去除DNA，經乙醇沉淀得到總RNA。純度高、完整性好的RNA，即可用于Northern雜交、純化mRNA、cDNA合成和體外翻譯等進一步的