用分離的亞細胞組分分析蛋白質的磷酸化
實驗材料樣品試劑、試劑盒胞內緩沖液透化緩沖液儀器、耗材離心管實驗步驟1. 分離細胞器。2. 于 4℃ 用胞內緩沖液清洗細胞器樣品 3 次，將相當于 1 mg 蛋白質的樣品轉至帶螺帽的小離心管，放入冰盒。3. 離心，吸去上清，加 200 μl 預熱至 37℃ 的透化緩沖液，輕輕混勻，放入 37℃ 水浴箱 。4. 加鏈球菌溶血素 O 儲存液至終濃度 60 單位/ml，加冷 ATP 儲存液至 100 μmol/L。5. 加 [γ-32P] ATP 至終濃度 50~500 μCi/ml。6. 加入要試驗的試劑，如激酶/磷酸酶抑制劑、蛋白質激酶或者磷酸酶。7. 制備免疫沉淀分析樣品或者 PAGE 樣品。展開 ......閱讀全文
用分離的亞細胞組分分析蛋白質的磷酸化
實驗材料樣品試劑、試劑盒胞內緩沖液透化緩沖液儀器、耗材離心管實驗步驟1. 分離細胞器。2. 于 4℃ 用胞內緩沖液清洗細胞器樣品 3 次，將相當于 1 mg 蛋白質的樣品轉至帶螺帽的小離心管，放入冰盒。3. 離心，吸去上清，加 200 μl 預熱至 37℃ 的透化緩沖液，輕輕混勻，放入 37℃ 水浴
用分離的亞細胞組分進行激酶分析
實驗材料細胞器樣品試劑、試劑盒激酶分析緩沖液ATP儀器、耗材SDS-PAGE 凝膠實驗步驟1. 準備反應混合物：反應體積通常是 50~100 ml。5X 激酶分析緩沖液????????????????????????????? 10 μl[γ-32P] ATP（終濃度 5 μCi/5μmol/L)?
亞細胞結構分離的技術
分離亞細胞組分的第一步是制備組織勻漿或細胞勻漿。勻漿（Homogenization）是在低溫條件下，將組織或細胞放在勻漿器中加入等滲勻漿介質（即0.25moL/L蔗糖一0.003mol/L氯化鈣溶液）研磨，使細胞被機械地研碎成為各種亞細胞組分和包含物的混合物。分離亞細胞組分的第一步是分級分離。它通過
亞細胞結構的分離與鑒定2
第三節 微粒體的分離細胞通過勻漿破碎時，細胞質膜碎成片段，這些膜片段的末端融合形成的直徑小于100nm的小泡。來自不同細胞器（細胞核、線粒體、質膜、內質網等）的小泡有不同的特性，所以可以將這些小泡相互分離。由內膜系統衍生而來的小膜泡形成相似大小的膜泡異質性集合體，稱微粒體（microsome）。分離
亞細胞構造的離心分離概論
現代生物學研究常常需要提取和純化細胞及組織中的亞細胞構造（細胞核、質膜、內笪綱、高爾基體、線粒體、溶酶體、微粒體等等）。在經過選擇的最合適的生物體勻漿制備后，用離心法提取和純化亞細胞構造是最常用、也是最有效的實驗手段。 （一）勻漿制備： 將生物體組織剪切成2~3毫米小塊或小片，以每100毫升加濕重
亞細胞結構的分離與鑒定1
細胞由各種亞細胞結構組成。其重要的研究手段之一是分離純化亞細胞組分，觀察它們的結構或進行生化分析。離心技術是實現這一目標的基本手段。一般認為，轉速為10～25Kr/min的離心機稱為高速離心機；轉速超過25Kr/min，離心力大于89Kg者稱為超速離心機。目前超速離心機的最高轉速可達100Kr/mi
亞細胞構造的離心分離典型實驗
一）簡介：用簡易的差分離心結合各種型式的密度梯度離心可以分離和純化各種亞細胞器。研究者也可以根據自己的設備情況對實驗參數做一定的改動，也可以更多地利用速率-區帶密度梯度離心或等密度離心來簡化實驗過程和提高分離純度。二）實驗：ⅰ）勻漿制備：?鼠肝12克加入0.25M蔗糖與5mM Tris-HCL(PH
細胞總蛋白質的分離提取
細胞器是一種動態的結構，如內質網、細胞核和高爾基體等，其蛋白質組成除了駐留蛋白質之外，還包括穿梭蛋白質和瞬間相互作用的蛋白質。對于這些組成成分的研究，即亞細胞蛋白質組研究將有助于對這些蛋白質做全面的挖掘，從而對細胞器的功能作深入的闡述。蛋白質提取與制備具體操作方法如下：一、材料的選擇早年為了研究的方
用淋巴細胞分離液分離單個核細胞
用淋巴細胞分離液分離單個核細胞1）分離外周血中的單個核細胞（PBMC）1．抽取正常人靜脈血加到肝素抗凝管中，加等量含5～10IU/ml肝素的無血清緩沖液懸浮細胞。將細胞懸液小心加在與血液等量的淋巴細胞分離液上，室溫中，水平離心500×g 20分鐘。此時離心管中形成5層：最上面是血漿，血漿層和淋巴細胞
用克隆環分離細胞克隆
實驗方法原理將集落在瓷制克隆環、玻璃環、PTFE 環或者不銹鋼環中用胰蛋由酶消化后移至24 孔或12 孔板中的一個孔或者直接種于 25 cm2 的培養瓶內。實驗材料胰蛋白酶 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?試劑、試劑盒
用克隆環分離細胞克隆
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 將集落在瓷制克隆環、玻璃環、PTFE 環或者不銹鋼環中用胰蛋由酶消化后移至24 孔或12 孔板中的一個孔或者直接種于 25 cm2 的培養瓶內。 實驗材料
用克隆環分離細胞克隆
實驗方法原理將集落在瓷制克隆環、玻璃環、PTFE 環或者不銹鋼環中用胰蛋由酶消化后移至24 孔或12 孔板中的一個孔或者直接種于 25 cm2?的培養瓶內。實驗材料胰蛋白酶試劑、試劑盒硅油儀器、耗材克隆培養環巴氏吸管生長培養基多孔板無菌鑷移液器粗頭筆實驗步驟1. 觀察細胞克隆，用氈制粗頭筆或 Nik
用克隆環分離細胞克隆
實驗方法原理 將集落在瓷制克隆環、玻璃環、PTFE 環或者不銹鋼環中用胰蛋由酶消化后移至24 孔或12 孔板中的一個孔或者直接種于 25 cm2 的培養瓶內。實驗材料 胰蛋白酶試劑、試劑盒 硅油儀器、耗材 克隆培養環巴氏吸管生長培養基多孔板無菌鑷移液器粗頭筆實驗步驟 1. 觀察細胞克隆，用氈制粗頭筆
透化細胞和退化細胞器中蛋白質的磷酸化實驗
試劑的制備單層培養細胞的透化懸浮培養細胞的透化用分離的亞細胞組分分析蛋白質的磷酸化用分離的亞細胞組分進行激酶分析試劑、試劑盒胞外緩沖液 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?胞內緩沖液 ? ? ? ? ? ?
透化細胞和退化細胞器中蛋白質的磷酸化實驗
試劑的制備 單層培養細胞的透化 懸浮培養細胞的透化 用分離的亞細胞組分分析蛋白質的磷酸化 用分離的亞細胞組分進行激酶分析 ? ? ? ? ? ?
蛋白質磷酸化
Tyrosine Kinase Assay Using Synthetic Peptides?(T. Miller)Small synthetic peptide substrates are especially well suited for applications such as assay
用蛋白質組學方法繪制磷酸化位點圖譜
方案1 用帶有 Fe(Ⅲ) 和 Ga(Ⅲ)的 IMAC 純化磷酸化多肽 方案2 在 MALDI 分析之前或之后對磷酸化多肽進行堿性磷酸酶處理 方案3 結合固定化金屬離子親和介質和 MALDI-TOF-MS 直接分析方法對磷酸化多肽進行特征分析實驗 方
蛋白質磷酸化的測定實驗
代謝標記 X射線片放射自顯影檢測32P標記的蛋白質 ? ? ? ? ? ? 實驗材料 細胞
細胞形態觀察（電鏡檢測）活率測定（亞細胞結構分離）
一、實驗內容1、細胞電子顯微鏡檢測2、細胞活率測定3、亞細胞結構的分離與鑒定 二、實驗設計 前一天細胞傳代: 1. （電鏡）中午每班傳細胞入含小蓋片培養瓶3瓶 晚上1瓶正常、2瓶損傷 次日損傷2瓶中，其中1瓶損傷恢復 2. （活率）中午每組
用尼龍毛法分離B細胞
用尼龍毛法分離B細胞1）尼龍毛柱的制備1．取直接3D，長度約250px的尼龍毛，用0.2mol/L HCl浸泡處理過夜。用雙蒸水洗凈HCl，置37℃烘干備用。2．稱取50mg尼龍毛，均勻分散，置Hanks液中浸泡。取1ml注射器，出口接塑料管并夾住。將尼龍毛均勻填塞入注射器中，排凈空氣，柱高約5～1
蛋白質分離實驗_分離已知pI－的蛋白質
實驗材料含10 mg蛋白質／ml 的溶于水的樣品試劑、試劑盒緩沖液（pH>pI）儀器、耗材50 μm 內徑的未包被的融合硅毛細管柱CE 儀器實驗步驟1. 用 pH 高于蛋白質的pI的 5 mmol/L 緩沖液 1/10 （V/F） 稀釋蛋白質樣品，使蛋白質（終濃度 = 1.0 mg/ml） 產生電荷
透化細胞和退化細胞器中蛋白質的磷酸化實驗—試劑制備
試劑、試劑盒胞外緩沖液胞內緩沖液透化緩沖液標準裂解緩沖液裂解緩沖液SDS-PAGE 加樣緩沖液雙向-PAGE 裂解緩沖液實驗步驟這些試劑在后面許多地方要用到，應在進行下述實驗前配好。1. 胞外緩沖液（pH 7.2，37℃）110 mmol/L NaCl10 mmol/L KCI1 mmol/L Mg
透化細胞和退化細胞器蛋白質磷酸化—單層培養細胞透化
實驗材料細胞培養物試劑、試劑盒HEPES儀器、耗材培養基實驗步驟1. 約在實驗開始前 1 小時，將細胞培養物換上含有預熱（37℃）的 20 mmol/L HEPES（pH 7.2）的培養基，繼續培養。讓細胞在實驗前與新培養基達成平衡。2. 將所需數量的有細胞的培養基放在一個絲網托盤上，放入 37℃
透化細胞和退化細胞器蛋白質磷酸化—懸浮培養細胞透化
實驗材料懸浮培養物試劑、試劑盒胞外緩沖液ATP 儲存液實驗步驟1. 約在實驗開始前 1 小時，用 50 ml 滅菌試管以 1000 g 離心懸浮培養物 5 分鐘，用 40 ml 左右胞外緩沖液清洗細胞兩次。用預熱至 37℃ 的胞外緩沖液重懸細胞至 107?細胞/ml。于 37℃ 輕輕搖動 15~30
怎么用離子交換層析分離蛋白質
6．洗脫：用含NaCL(0.2-0.6M)的0.02MTris-HCL緩沖液pH7.4(內含0.等電聚焦電泳（IEF）分離蛋白及測定蛋白質等電點一、原理等電點聚焦（IEF）
蛋白質磷酸化最重要的機制
蛋白質磷酸化是調節和控制蛋白質活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的機制。蛋白質磷酸化主要發生在兩種氨基酸上，一種是絲氨酸(包括蘇氨酸)，另一種是酪氨酸。這兩類酸磷酸化的酶不一樣，功能也不一樣，但也有少數雙功能的酶可以同時作用于這兩類氨基酸，如MEK(促絲裂原活化蛋白激酶激酶mitogen-a
蛋白質磷酸化的最重要的機制
蛋白質磷酸化是調節和控制蛋白質活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的機制。蛋白質磷酸化主要發生在兩種氨基酸上，一種是絲氨酸(包括蘇氨酸)，另一種是酪氨酸。這兩類酸磷酸化的酶不一樣，功能也不一樣，但也有少數雙功能的酶可以同時作用于這兩類氨基酸，如MEK(促絲裂原活化蛋白激酶激酶mitogen-act
蛋白質磷酸化的最重要的機制
蛋白質磷酸化是調節和控制蛋白質活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的機制。蛋白質磷酸化主要發生在兩種氨基酸上，一種是絲氨酸(包括蘇氨酸)，另一種是酪氨酸。這兩類酸磷酸化的酶不一樣，功能也不一樣，但也有少數雙功能的酶可以同時作用于這兩類氨基酸，如MEK(促絲裂原活化蛋白激酶激酶mitogen-act
蛋白質內序列分析用肽段的分離與純化實驗
試劑、試劑盒 考馬斯亮藍 G乙酸甲醇Achromobacter 胰蛋白酶 I 三氟乙酸乙腈2-丙醇儀器、耗材 SpeedVac 型旋轉濃縮器Tween-20UltrafreeTM MC 濾器C18 反相 HPLC 柱實驗步驟 材料與設備考馬斯亮藍 G(0.05% 的乙酸-20% 甲醇溶液）乙酸 (5
蛋白質內序列分析用肽段的分離與純化實驗
分子生物學中最重要的環節之一是對微量蛋白質進行分析，使對編碼待研究蛋白的 cDNA 序列的克隆成為可能。為有效地做到這一點，通常需要知道蛋白質的內序列。在這一方面，肽段的有效分離是極重要的。本實驗來源于蛋白質純化與鑒定實驗指南，作者：朱厚礎。試劑、試劑盒考馬斯亮藍 G乙酸甲醇Achromobacte