從包涵體中純化表達蛋白
實驗材料 表達靶蛋白的大腸桿菌細胞試劑、試劑盒 細胞裂解緩沖液 I細胞裂解緩沖液Ⅱ脫氧膽酸濃鹽酸包涵體溶解緩沖液 I包涵體溶解緩沖液ⅡKOHPMSFSDS 凝膠加樣緩沖液含尿素的 Tris-ClDNaseI溶菌酶SDS-聚丙烯酰胺凝膠儀器、耗材 Sorvall GSA 轉頭或相當的轉頭pH 試紙磨光玻璃棒實驗步驟 材料緩沖液和溶液貯存液、緩沖液和試劑的成分請參見附錄 1。貯存液稀釋至適當濃度。細胞裂解緩沖液 I50 mmol/LTris-Cl(pH8.0)1mmol/LEDTA(pH8.0)100 mmol/LNaCl細胞裂解緩沖液Ⅱ, 冰冷50 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)10 mmol/L EDTA(pH8.0)100 mmol/LNaCl0.5% TritonX-100脫氧膽酸使用蛋白級的膽酸/去污劑。HCl(12mol/L)(濃鹽酸）包涵體溶解緩沖液 I50 mmol/LTris-Cl(pH8.0)1 mm......閱讀全文
從包涵體中純化表達蛋白
實驗材料 表達靶蛋白的大腸桿菌細胞試劑、試劑盒 細胞裂解緩沖液 I細胞裂解緩沖液Ⅱ脫氧膽酸濃鹽酸包涵體溶解緩沖液 I包涵體溶解緩沖液ⅡKOHPMSFSDS 凝膠加樣緩沖液含尿素的 Tris-ClDNaseI溶菌酶SDS-聚丙烯酰胺凝膠儀器、耗材 Sorvall GSA 轉頭或相當的轉頭pH 試紙磨光
從包涵體中純化表達蛋白
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 蛋白質在大腸桿菌中的高水平表達，常常導致形成相差顯微鏡下可見的細胞質顆粒或包涵體。這些由表達蛋白聚集成的包涵體很容易與可溶性蛋白和膜結合蛋白分離。高水平表達外源蛋白的細菌經離心濃縮后，可通過機械法、超聲處理法或溶菌酶加去污劑的方
從包涵體中純化表達蛋白
實驗方法原理蛋白質在大腸桿菌中的高水平表達，常常導致形成相差顯微鏡下可見的細胞質顆粒或包涵體。這些由表達蛋白聚集成的包涵體很容易與可溶性蛋白和膜結合蛋白分離。高水平表達外源蛋白的細菌經離心濃縮后，可通過機械法、超聲處理法或溶菌酶加去污劑的方法進行裂解。包涵體經離心沉淀后，可用Triton X-100
包涵體表達蛋白的純化方法
Joseph SambrookPeter Maccallum Cancer Institute and The University of Melbourne, AustraliaDavid W. RussellUniversity of Texas Southwestern Medical Cen
包涵體的純化
關于包涵體的純化是一個令人頭疼的問題，包涵體的復性已經成為生物制藥的瓶頸，關于包涵體的處理一般包括這么幾步：菌體的破碎、包涵體的洗滌、溶解、復性以及純化，內容比較龐雜?一、菌體的裂解?1、怎樣裂解細菌？?細胞的破碎方法?1.高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調速器
包涵體的純化
關于包涵體的純化是一個令人頭疼的問題，包涵體的復性已經成為生物制藥的瓶頸，關于包涵體的處理一般包括這么幾步：菌體的破碎、包涵體的洗滌、溶解、復性以及純化，內容比較龐雜?一、菌體的裂解?1、怎樣裂解細菌？?細胞的破碎方法?1.高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調速器
包涵體的純化-5
還原劑：?由于蛋白間二硫鍵的存在，在增溶時一般使用還原劑。還原劑的使用濃度一般是50-100mM2-BME或DTT，也有文獻使用5mM濃度。在較粗放的條件下，可以使用5ml/l的濃度。還原劑的使用濃度與蛋白二硫鍵的數目無關，而有些沒有二硫鍵的蛋白加不加還原劑無影響，如牛生長激素包涵體的增溶。對于目標
包涵體的純化-4
9、什么叫復性成功?復性效果的檢測：?根據具體的蛋白性質和需要，可以從生化、免疫、物理性質等方面對蛋白質的復性效率進行檢測。?1，凝膠電泳：一般可以用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳可以檢測變性和天然狀態的蛋白質，或用非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測有二硫鍵的蛋白復性后二硫鍵的配對情況。?2，光譜學方法：可以用
包涵體的純化-3
做完裂解之后加Triton X－100輕搖３０min，蛋白溶解的會多些！?四、包涵體的復性?1、包涵體如何復性?包涵體的復性主要有兩種方式：?1，稀釋溶液，但是操作的液體量大，蛋白稀釋?2，透析，超濾或電滲透析去除變性劑?其中透析很適合實驗室應用，但是時間長。另外，如果蛋白質右兩個以上的2硫鍵，很可
包涵體的純化-2
1.2.7重組融合蛋白的純化?PrP-pET-32a（+）轉化表達菌E.coli BL21（DE3），TB培養基中，25℃，AMP 200 ug/ml，搖床（250 r／min）培養至OD600約為1.5，更換等體積新鮮TB培養基，加入IPTG至終濃度1 mM，AMP 200 ug/ml，25℃，4