外源基因在大腸桿菌中誘導表達與檢測
原理目的基因被克隆到pET質粒載體上，受噬菌體T7強轉錄及翻譯(可選擇)信號控制；表達由宿主細胞提供的T7 RNA 聚合酶誘導。T7 RNA 聚合酶機制十分有效并具選擇性：充分誘導時，幾乎所有的細胞資源都用于表達目的蛋白；誘導表達后僅幾個小時，目的蛋白通常可以占到細胞總蛋白的50%以上。在培養體系中加入IPTG 誘導T7 RNA 聚合酶生產，繼而質粒上的目的DNA 開始轉錄。本實驗采用已經構建好的表達載體pET，該載體帶有來源于古細菌的單鏈結合蛋白質（SSB）的序列，經IPTG的誘導，實現外源基因的表達，并通過SDS-PAGE對表達產物進行檢測。一、主要儀器、材料、和試劑1. 儀器恒溫搖床，臺式高速離心機，恒溫水浴鍋，垂直板蛋白質電泳裝置，生化培養箱，電泳儀，超凈工作臺，移液器。2. 材料含有表達載體pET-28的BL21菌株。3. 試劑IPTG 儲液(200mg/ml)：在800μl 蒸餾水中溶解200mg IPTG ......閱讀全文
外源基因的誘導表達
1．目的了解外源基因在原核細胞中表達的特點和方法。2．原理外源基因克隆在含有lac啟動子的表達系統中。先讓宿主菌生長，lac I產生的阻遏蛋白與lac操縱基因結合抑制下游的外源基因轉錄。向培養基中加入誘導物IPTG（異丙基硫代-b-D-半乳糖），解除抑制使外源基因大量表達。表達的蛋白可經SDS-
外源基因在大腸桿菌中誘導表達與檢測
原理目的基因被克隆到pET質粒載體上，受噬菌體T7強轉錄及翻譯(可選擇)信號控制；表達由宿主細胞提供的T7 RNA 聚合酶誘導。T7 RNA 聚合酶機制十分有效并具選擇性：充分誘導時，幾乎所有的細胞資源都用于表達目的蛋白；誘導表達后僅幾個小時，目的蛋白通常可以占到細胞總蛋白的50%以上。在培養體
基因重組以及外源基因在大腸桿菌中的誘導表達
一、實驗目的學習和掌握基因重組以及外源基因在大腸桿菌中誘導表達的方法。二、實驗原理通過基因重組可將外源基因導入細胞，并使之進行擴增或表達。在生命科學的研究中，基因重組已經不僅是研究的目的（如基因工程的上游工程），而且日益成為一項重要的研究手段（如基因功能研究中將研究對象基因單獨分離后重組，可以研究其
外源基因在真核細胞表達技術
生化方法l??????磷酸鈣介導的質粒DNA轉染真核細胞1.??????轉染前24 h，通過胰酶消化收集細胞，用適當的完全培養基以1×105至4×105細胞/cm2的密度平鋪細胞于60 mm組織培養皿或12孔板上。于含5%～7% CO2的37℃溫箱孵育20～24 h。轉染前1 h換液。2.?????
外源基因在原核細胞表達技術
原核細胞l??????用IPTG誘導啟動子在大腸桿菌中表達克隆化基因?含重組表達載體的大腸桿菌菌株的構建1.??????PCR修飾或限制性內切酶消化分離DNA片段，片段5’端和3’端帶有與IPTG誘導表達載體對應的限制酶位點。2.??????含靶cDNA/基因的DNA片段與表達載體連接。3.????
外源基因在真核細胞表達技術
生化方法*?磷酸鈣介導的質粒DNA轉染真核細胞轉染前24 h，通過胰酶消化收集細胞，用適當的完全培養基以1×105至4×105細胞/cm2的密度平鋪細胞于60 mm組織培養皿或12孔板上。于含5%～7% CO2的37℃溫箱孵育20～24 h。轉染前1 h換液。2.按照下屬方法制備磷酸鈣-DNA沉淀：
外源基因在原核細胞表達技術
原核細胞*用IPTG誘導啟動子在大腸桿菌中表達克隆化基因?含重組表達載體的大腸桿菌菌株的構建1.PCR修飾或限制性內切酶消化分離DNA片段，片段5’端和3’端帶有與IPTG誘導表達載體對應的限制酶位點。2.含靶cDNA/基因的DNA片段與表達載體連接。3.重組質粒轉化有lacIq?等位基因的大腸桿菌
在大腸桿菌中高效表達外源蛋白的策略
? 本世紀60至70年代對大腸桿菌的研究使之成為自然界中最普遍為人們所認識的生物體。? ? 大腸桿菌具有兩個顯著特征：操作簡單和能在廉價的培養基中高密度培養，它的這些特征加上十多年外源基因表達的經驗使其在大多數科研應用中成為高效表達異源蛋白最常用的原核表達系統。盡管大腸桿菌有眾多的優點，但并非每一種
目的基因在大腸桿菌中的誘導表達
[實驗原理] 將克隆化基因插入合適載體后導入大腸桿菌用于表達大量蛋白質的方法一般稱為原核表達。這種方法在蛋白純化、定位及功能分析等方面都有應用。大腸桿菌用于表達重組蛋白有以下特點：易于生長和控制；用于細菌培養的材料不及哺乳動物細胞系統的材料昂貴；有各種各樣的大腸桿菌菌株及與之匹配的具
外源基因在真核細胞中的表達系統
1. 真核生物表達的優越性和必要性① 真核生物具有轉錄后加工系統，可識別并刪除基因中的內含子，剪切加工為成熟mRNA.②具備完善的翻譯后加工系統，可進行糖基化、乙酰化等修飾，使蛋白形成正確的天然構型，因而真核生物表達系統產生的蛋白更接近天然狀態，有利于其功能、生物活性的研究。③某些真核細胞可將基因表
外源基因在原核細胞中的表達系統
外源基因在原核細胞中表達是基因工程操作中最初取得成功的途徑。1 原核生物基因表達的特點同所有的生命過程一樣，外源基因在原核細胞中的表達包括兩個主要過程:即 DNA轉錄成mRNA和 mRNA翻譯成蛋白質。與真核細胞相比，原核細胞的表達有以下特點:①原核生物只有一種RNA 聚合酶(真核細胞有三種)識別原
外源基因表達新進展，工具豬價值翻倍
近日，中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院賴良學課題組在可誘導外源基因表達工具豬培育及其應用取得新進展，成功建立了僅需一輪體細胞克隆，即可獲得可穩定遺傳的藥物調控外源基因表達的工具豬模型。相關研究在線發表于Science China Life Sciences。 高表達外源基因的基因修飾豬在生物醫
外源質粒DNA轉化大腸桿菌
摘要： 轉化是將外源DNA分子通過物理或化學的方法導入基因工程細菌中的過程,是基因工程等研究領域的基本實驗技術之一. 外源質粒 DNA 轉化 大腸桿菌 1 實驗簡介 轉化是將外源DNA分子通過物理或化學的方法導入基因工程
基因編輯家蠶表達外源絲蛋白研究獲進展
近日，國際學術期刊PNAS Nexus在線發表了江蘇科技大學生物技術學院/農業農村部蠶桑遺傳改良重點實驗室教授譚安江團隊的研究成果，該研究通過構建多種家蠶絲腺表達體系，實現了蜘蛛和袋蛾絲蛋白等在家蠶內的大量表達，為利用家蠶作為生物反應器開展定制化絲蛋白生產提供了新的途徑。據介紹，自然界中除家蠶外，有
DNA重組（DNA－recombination）技術：外源基因的蛋白表達3
（6）遺傳標記： 從成千上萬個哺乳細胞中，檢測出極少數的含DNA重組體的轉染細胞，并鑒定已導入外源DNA是哺乳動物細胞基因表達系統的一個關鍵內容。因此，在真核生物表達載體上必須附有標記基因，才能進行篩選。常用的標記基因有：胸苷激酶基因（thymidine kinase，TK）、二氫葉酸還原酶
DNA重組（DNA－recombination）技術：外源基因的蛋白表達1
通過外源DNA的重組、克隆、以及鑒定，可以獲得所需的特異DNA克隆。外源克隆基因在某種表達載體及適宜的宿主細胞中可表達為相應的蛋白質，這就組成了外源基因的蛋白表達系統。表達后的蛋白質必須具有原來的生物學活性，這是基于正確的基因轉錄、轉錄后加工、mRNA翻譯及翻譯后修飾，同時與表達載體的結構和表達體系
DNA重組（DNA－recombination）技術：外源基因的蛋白表達2
2.包涵體的分離與純化細胞破碎時提取細胞內產物的關鍵。對于細菌的裂解常用的有酶溶法、超聲破碎法、化學滲透法、玻璃珠研磨等。包涵體可通過超聲波、勻漿等常規的方法是菌體破碎后，離心就可得到。密度梯度離心后可得到高純度的包涵體。包涵體一般不溶于水，為了獲得可溶性的蛋白質可加入強蛋白質變性劑后使其溶解。一般
DNA重組（DNA－recombination）技術：外源基因的蛋白表達4
（3）CHO細胞穩定表達系統：動物細胞瞬時表達系統中外源基因沒有穩定地整合到宿主細胞染色體中，一染色體外DNA的形式存在。因而只能瞬時表達。要使外源基因在宿主細胞中高效、穩定地表達，必須建立一個穩定表達系統，包括適宜的表達載體、有效的基因轉染、標記基因和目標基因的選擇與共擴增、受體適當的受體細胞和培
酵母表達外源蛋白（foreign－protein）（4）
15、菌體密度：菌體是在BMMY中培養的，可以不用BMMY做對照，在600nm處測OD值，培養基和PBS光吸收都很低，PBS更方便。麥芽浸提液培養酵母（不換液，補料），生長階段結束后，密度可達到10-12，誘導培養結束后，密度可達到18左右。如果用1體積的BMGY，在生長階段結束后，換液時，加入1/
酵母表達外源蛋白（foreign－protein）（5）
或者第5步和第6步改為丙酮洗:5.加入200ul冰冷的丙酮，用手指輕彈EP管，洗去管底和管壁殘余的TCA。6.15000g,離心10－20分鐘,倒掉上清，將EP管倒扣在吸水紙上輕輕控幾下，除去殘余在管口的液體。樣品是酵母細胞超聲后離心獲得的上清，用Loading buffer溶解蛋白沉淀，始終不
酵母表達外源蛋白（foreign－protein）（2）
如果是用自己配置的培養基，如玉米浸提液、麥芽浸提液、麥麩浸提液等等，可以不用換液，采取添料來維持酵母對培養基的營養需要。用無機鹽進行大規模發酵，更省錢。大規模發酵時，甲醇的流加速度增加不要太快。另外使用純氧并不昂貴，在武漢買個鋼瓶600元左右，一瓶純氧20元。一個批次100h左右估計3－4 瓶氧氣。
酵母表達外源蛋白（foreign－protein）（1）
1、 菌株用GS115表達不出蛋白，換KM71H后，大部分克隆能表達。2、溫度： 在28度和室溫下誘導表達，表達水平可能都不低。3、pH手冊上用6.0，pH提高到6.8，不表達的蛋白可能就表達出來。BMMY的pH7.0-7.5比較合適。國內外做的最好的rHSA，最適pH大概 5-6左右。pH3的時候
酵母表達外源蛋白（foreign－protein）（3）
12、蛋白降解分泌表達的目標蛋白比胞內蛋白確實容易被降解。可以嘗試以下幾種辦法：1、盡可能降低培養液的pH值減少酶活，酵母生長pH值比較廣，4～7都可以試一下；2、多試幾種蛋白添加劑，充當酶解底物（比如酵母酸）；3、摸索最適下罐（搖瓶也一樣），寧可少表達點也別給降解光了。實在沒辦法，只好換菌株或做p
IPTG誘導大腸桿菌表達目標蛋白的作用原理
用乳糖操縱子作為啟動子進行蛋白質表達的時候,需要誘導物進行誘導(相當于點火),但乳糖可以被細胞利用掉,所以利用IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)在結構上與乳糖的相似性也可以將基因表達啟動,但它不能被細胞利用掉,從而實現持續的表達.
IPTG誘導大腸桿菌表達目標蛋白的作用原理
用乳糖操縱子作為啟動子進行蛋白質表達的時候,需要誘導物進行誘導(相當于點火),但乳糖可以被細胞利用掉,所以利用IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)在結構上與乳糖的相似性也可以將基因表達啟動,但它不能被細胞利用掉,從而實現持續的表達.
外源DNA的基因特點
基因有兩個特點，一是能忠實地復制自己，以保持生物的基本特征；二是基因能夠“突變”，突變絕大多數會導致疾病，另外的一小部分是非致病突變。非致病突變給自然選擇帶來了原始材料，使生物可以在自然選擇中被選擇出最適合自然的個體。含特定遺傳信息的核苷酸序列，是遺傳物質的最小功能單位。除某些病毒的基因由核糖核酸（
細胞化學詞匯外源基因
中文名稱：外源基因英文名稱：exogenous gene定 義：經轉基因步驟導入受體細胞的基因。應用學科：遺傳學（一級學科），分子遺傳學（二級學科）
外源基因轉化的用途
利用外源基因轉化已經產生了轉基因學科，利用重組DNA技術可以將以前沒有的新特性引入生物體。通過轉基因創造的生物體很多，從細菌到哺乳動物，包括綿羊和猴子，它們有多種用途：用于研究發育遺傳學、疾病過程和基因調控等。轉基因動物可以生產藥物，并增加牛奶或肉類的產量。來自轉基因動物的組織和器官可以用于輸血和移
外源基因轉移技術介紹
外源基因的轉移：基因轉移（gene transfer）是將外源基因導入細胞內，其轉移方法較多，常用的要有下列幾類：1）化學法：將正常基因DNA（及其拷貝）與帶電荷物質和磷酸鈣、DEAE－葡萄糖或與若干脂類混合，形成沉淀的DNA微細顆粒，直接傾入培養基中與細胞接觸，由于鈣離子有促進DNA透過細胞有作用
IPTG誘導大腸桿菌表達目標蛋白的作用原理是
用乳糖操縱子作為啟動子進行蛋白質表達的時候,需要誘導物進行誘導(相當于點火),但乳糖可以被細胞利用掉,所以利用IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)在結構上與乳糖的相似性也可以將基因表達啟動,但它不能被細胞利用掉,從而實現持續的表達.