固相pH梯度等電聚焦實驗——制膠
實驗方法原理固相 pH 梯度凝膠是由固相 pH 梯度介質（丙烯酰胺衍生物）共價結合到聚丙烯酰胺凝膠中并形成 pH 梯度，所以制膠過程比載體兩性電解質凝膠復雜。灌膠的方法與常規聚丙烯酰胺梯度凝膠和 SDS 梯度凝膠相似。高質量的凝膠介質和固相 pH 梯度介質，聚合過程以及漂洗對固相 pH 梯度凝膠是非常重要的。試劑、試劑盒丙烯酰胺單體貯液過硫酸銨貯液儀器、耗材灌膠模具實驗步驟1. 選擇 pH 范圍，計算緩沖與滴定 Immobiline 的體積對未知樣品 pH 范圍的選擇，最好先用寬范圍（如 pH 3.5~10 ) 載體兩性電解質等電聚焦確定其等電點的位置，再選擇窄范圍的固相 pH 梯度等電聚焦。確定范圍后，根據表 7.4 和 7.5 査得或進一步用內插法計算得到緩沖和滴定 Immobiline 的體積。2. 貯液配置丙烯酰胺單體貯液：溶解 14.55 g 丙烯酰胺和 0.45 g N,N'-甲叉雙丙烯酰胺在 35 ml 雙......閱讀全文
固相pH梯度等電聚焦實驗——制膠
實驗方法原理固相 pH 梯度凝膠是由固相 pH 梯度介質（丙烯酰胺衍生物）共價結合到聚丙烯酰胺凝膠中并形成 pH 梯度，所以制膠過程比載體兩性電解質凝膠復雜。灌膠的方法與常規聚丙烯酰胺梯度凝膠和 SDS 梯度凝膠相似。高質量的凝膠介質和固相 pH 梯度介質，聚合過程以及漂洗對固相 pH 梯度凝膠是非
固相pH梯度等電聚焦實驗——等電聚焦
試劑、試劑盒丙烯酰胺單體貯液過硫酸銨貯液實驗步驟打開循環水浴，設置冷卻溫度，一般為 10℃。將制好的固相 pH 梯度凝膠鋪在冷卻板上，注意正負極。其間涂以液體石蠟或煤油，避免氣泡陷入，以保證膠板和冷卻板之間的良好接觸。用合適的電極溶液（參見表 7.7) 潤濕濾紙電極條，分別放置凝膠的酸、堿側。有的儀
固相pH梯度等電聚焦實驗
制膠 等電聚焦 pH 梯度的測定 檢測 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 固相 pH 梯度凝膠是由固相 pH 梯度介質（丙烯酰胺衍生物）共價結合到聚
固相pH梯度等電聚焦實驗
實驗方法原理 固相 pH 梯度凝膠是由固相 pH 梯度介質（丙烯酰胺衍生物）共價結合到聚丙烯酰胺凝膠中并形成 pH 梯度，所以制膠過程比載體兩性電解質凝膠復雜。灌膠的方法與常規聚丙烯酰胺梯度凝膠和 SDS 梯度凝膠相似。高質量的凝膠介質和固相 pH 梯度介質，聚合過程以及漂洗對固相 pH
固相pH梯度等電聚焦實驗——檢測
試劑、試劑盒丙烯酰胺單體貯液過硫酸銨貯液實驗步驟1. 各種染色方法在所述的染色方法，包括各種考馬斯亮藍方法、銀染色、熒光探針法、放射自顯影、免疫固定等均適用于固相 pH 梯度等電聚焦后的檢測。作者實驗室進行轉鐵蛋白的考馬斯亮藍 R-250 染色時，脫色困難。用 G-250 染色時，脫色同樣困難。為了
固相pH梯度等電聚焦實驗——pH－梯度的測定
試劑、試劑盒丙烯酰胺單體貯液過硫酸銨貯液實驗步驟由于固相 pH 梯度凝膠的導電性很低，不可能用表面電極測定凝膠表面的 pH。但對于寬范圍的固相 pH 梯度可以用等電點蛋白標準來測定，方法同載體兩性電解質等電聚焦。但目前還沒有合適的市售蛋白標準可用于測定窄范圍的固相 pH 梯度。灌制凝膠時，pH 梯度
一維固相－pH－梯度等電聚焦－(IEF－with－IPG)——膠條處理
實驗材料膠條實驗步驟用于2-DE 時，膠條應該散于重泡脹池（圖 3, ld) 中在含 5mol/L 尿素的溶液（或2mol/L 硫脲和 5mol/L 尿素）中泡脹。溶液其成分為 0,5% 到 4% 非離子（NP-40,Triton X-100) 或兩性 (CHAPS) 去污劑、 15mmol/LDT
一維固相－pH－梯度等電聚焦－(IEF－with－IPG)
實驗方法原理 IPG IEF 膠用 Immobilines制備。 lmmobilines 是擁有 結構的8 種丙烯酰胺衍生物系列，其中 R 包含羧基或叔氨基團，它們構成了分布在 pH3-10 不同值的緩沖體系。根據公布的配方估算后，將適宜的 IPG 試劑添加至混合物中用于凝膠聚合，在聚合
一維固相－pH－梯度等電聚焦－(IEF－with－IPG)
基本方案 膠條處理 加樣 IPG IEF pH 梯度的選擇 聚焦時間的優化 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 IPG
固相pH梯度等電聚焦電泳色譜儀概述
固相pH梯度等電聚焦電泳色譜儀比載體兩性電解質pH梯度等電聚焦電泳色譜儀具有更高的分辨率，更大的上樣量，其分辨率可達0.001pH，是目前分辨率zui高的電泳儀之一。一、工作原理：蛋白質分子按照自己的pI位置在固相pH梯度中遷移，達到自己的等電點時停止遷移。二、固相pH梯度的介質：固相pH梯度（IP
一維固相pH梯度等電聚焦－(IEF－with－IPG)——IPG－IEF－pH－梯度的選擇
實驗材料膠條實驗步驟對一新樣品，常最先使用寬范圍、線性PH3.5-10梯度 但對大多數樣品，這樣做會喪失 pH4-7 區域的分辦率，許多蛋白質的 pI 值在該區域。利用非線性 pH3.5-10 IPG IEF 膠在一定程度緩解這個問題。 PH3.5-10 非線性膠條在 pH4-7 區域的梯度要比 p
一維固相－pH－梯度等電聚焦－(IEF－with－IPG)——加樣
實驗材料蛋白樣品實驗步驟樣品通常是加在放置在?IPG?膠陽極區或陰極區的硅橡膠框內或特殊加樣杯內（圖3. lg, h),?對不同類型的樣品，最好的加樣位置由經驗值確定。最初電壓衛限制在150V?、?30min,?從而使盡隊多的樣品進入加樣杯，然后逐漸增加電壓至3500 V?。運行時間決定了幾個不同的
等電聚焦電泳色譜儀固相pH梯度的形成
等電聚焦電泳色譜儀固相pH梯度的介質是Immobilines試劑，不是兩性分子，在凝膠聚合時便形成pH梯度，不隨環境電場條件的改變而改變。Immobilines試劑的分子式為CH2 = CH－CO－NH－R，其中R代表羧基或第三氨基，每個分子都有一個單一的酸性或堿性緩沖基團與丙烯酰胺單連。分子一端的
一維固相－pH－梯度等電聚焦－(IEF－with－IPG)——聚焦時間的優化
實驗材料蛋白樣品實驗步驟理論上講，要獲得最好的圖譜質量和重復性所需最佳時間是 IEF 分離達到穩定態所需的時間 。 若聚焦時間太短，會導致水平和垂直條紋，但要避免過度聚焦 。 雖然與經典 O'Farrell 法相比，不會導致蛋白質向陰極的遷移（陰極漂移），但卻會因為活性水轉運而導致過多水在
一維固相－pH－梯度等電聚焦－(IEF－with－IPG)——基本方案
實驗方法原理IPG IEF 膠用 Immobilines制備。 lmmobilines 是擁有?結構的8 種丙烯酰胺衍生物系列，其中 R 包含羧基或叔氨基團，它們構成了分布在 pH3-10 不同值的緩沖體系。根據公布的配方估算后，將適宜的 IPG 試劑添加至混合物中用于凝膠聚合，在聚合中，緩沖基團通
載體兩性電解質pH梯度等電聚焦實驗—薄層分析等電聚焦
實驗方法原理利用蛋白質分子或其他兩性分子的等電點的不同，在一個穩定的、連續的、線性 pH 梯度中進行蛋白質的分離和分析。所以利用等電聚焦技術分析的對象只限于蛋白質和兩性分子。分析的條件是凝膠中有穩定的、連續的和線性的 pH 梯度。試劑、試劑盒丙烯酰胺單體貯液過硫酸銨貯液儀器、耗材注射器水浴實驗步驟一
載體兩性電解質pH梯度等電聚焦實驗
實驗方法原理?利用蛋白質分子或其他兩性分子的等電點的不同，在一個穩定的、連續的、線性 pH 梯度中進行蛋白質的分離和分析。所以利用等電聚焦技術分析的對象只限于蛋白質和兩性分子。分析的條件是凝膠中有穩定的、連續的和線性的 pH 梯度。試劑、試劑盒?丙烯酰胺單體貯液過硫酸銨貯液儀器、耗材?注射器水浴實驗
等電聚焦電泳色譜儀pH梯度的類型
等電聚焦電泳色譜儀是利用蛋白質分子或其它兩性分子的等電點不同，在一個穩定的、連續的和線性的pH梯度中進行分離，具有靈敏度高、分辨率高和重復性好等特點，特別適合大批量純度檢測和真實性鑒定以及遺傳多樣性等群體生物學領域的研究。pH梯度按形成方式可分為載體兩性電解質pH梯度和固相pH梯度等。一、載體兩性電
等電聚焦電泳色譜儀pH梯度的形成過程
等電聚焦電泳色譜儀是在電泳介質中放入載體兩性電解質，當通以直流電時，載體兩性電解質形成一個由陽極到陰極逐步增加的pH梯度，不同的蛋白質移動到其相當的等電點位置上，聚焦于一個狹窄區帶中而達到分離。載體兩性電解質是一系列脂肪族多氨基多羧酸同系物和異構體組成的混合物，具有很多既不相同又十分接近的相互連接的
等電聚焦電泳的梯度組成
pH梯度的組成方式有二種，一種是人工pH梯度，由于其不穩定，重復性差，現已不再使用。另一種是天然pH梯度。天然pH梯度的建立是在水平板或電泳管正負極間引入等電點彼此接近的一系列兩性電解質的混合物，在正極端引入酸液，如硫酸、磷酸或醋酸等，在負極端引入堿液，如氫氧化鈉、氨水等。電泳開始前兩性電解質的
等電聚焦電泳色譜儀pH梯度的建立方式
等電聚焦電泳色譜儀是利用蛋白質分子或其它兩性分子的等電點不同，在一個穩定的、連續的和線性的pH梯度中進行分離，等電聚焦電泳的關鍵是pH梯度的建立。 01 人工建立pH梯度： 在電場下利用不同pH值緩沖液相互擴散，在混合區間形成pH梯度。此pH梯度易受緩沖液離子的遷移和擴散而變動，重復性差
等電聚焦電泳色譜儀pH梯度的建立方式
等電聚焦電泳色譜儀是利用蛋白質分子或其它兩性分子的等電點不同，在一個穩定的、連續的和線性的pH梯度中進行分離，等電聚焦電泳的關鍵是pH梯度的建立。一、人工建立pH梯度：在電場下利用不同pH值緩沖液相互擴散，在混合區間形成pH梯度。此pH梯度易受緩沖液離子的遷移和擴散而變動，重復性差，已不被采用。二、
等電聚焦電泳色譜儀pH梯度的建立方式
等電聚焦電泳色譜儀是利用蛋白質分子或其它兩性分子的等電點不同，在一個穩定的、連續的和線性的pH梯度中進行分離，等電聚焦電泳的關鍵是pH梯度的建立。 一、人工建立pH梯度： 在電場下利用不同pH值緩沖液相互擴散，在混合區間形成pH梯度。此pH梯度易受緩沖液離子的遷移和擴散而變動，重復性差，已不
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗
方案1 雙向凝膠電泳鼠肝蛋白質提取物的制備實驗 方案2 雙向凝膠電泳真核生物細胞裂解物的制備實驗 方案3 雙向凝膠電泳大腸桿菌裂解液的制備實驗 方案4 雙向凝膠電泳腦脊液蛋白樣品的制備實驗 方案5 第一向：蛋白質的等電聚焦電泳實驗
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗
方案4 雙向凝膠電泳腦脊液蛋白樣品的制備實驗實驗方法原理可用乙醇沉淀人類腦脊液以濃縮其中的蛋白質和除去鹽分，否則這些物質會干擾第一向?IEF。實驗材料人類腦脊液試劑、試劑盒乙醇NaOH增溶溶液β-巰基乙醇儀器、耗材離心管冷凍離心機超聲波儀實驗步驟1.在室溫下解凍腦脊液樣品。當樣品解凍后，旋緊試管蓋，
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗
實驗方法原理 肝與其他動物組織一樣，可制備用作雙向電泳的材料。離心之后，溶于合適的溶液中即可。不需要濃縮蛋白質或去除干擾物質等額外步驟。所用抽提溶液包括脲、硫脲和酰胺烷基硫代甜采堿去垢劑ASB-14，它們配合使用可最大量地溶解蛋白質。實驗材料 鼠肝試劑、試劑盒 二硫蘇糖醇（DTT)抽提溶液苯甲基硫酰
等電聚焦電泳色譜儀pH梯度不穩定的原因
等電聚焦電泳色譜儀是利用蛋白質分子或其它兩性分子的等電點不同，在一個穩定的、連續的、線性的pH梯度中進行分離。等電聚焦電泳技術在不斷進步，卻一直存在著pH值梯度不穩定的現象，即存在著pH梯度的陰極和陽極漂移現象。陰極漂移是指在等電聚焦電泳中pH梯度的堿性端逐漸消失的過程。反之，如果其酸性端逐漸消失則
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗3
方案3 雙向凝膠電泳大腸桿菌裂解液的制備實驗 實驗方法原理 細菌裂解液含大量核酸，在進行雙向凝膠電泳之前，需先對核酸進行處理。可通過超聲波處理包含脲和 CHAPS 的細菌提取液。當脲存在時，核酸酶（Benzonase) 是有活性的，但是其活性依賴于 Mg2+。核酸酶處理后加入 ED
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗14
方案14 雙向凝膠的槽式轉移實驗 實驗材料 包含蛋白質樣品的凝膠 試劑、試劑盒 轉移緩沖液 儀器、耗材 印跡紙硝化纖維素薄膜或 PVDF 膜電源電泳轉移設備 實驗步驟 1.測量 SDS-PAGE 凝膠的尺寸，將轉移膜剪成與凝膠相適應的尺寸。 槽
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗16
方案16?用麗春紅 S 染色膜上的蛋白質 實驗材料 轉膜的蛋白質 試劑、試劑盒 麗春紅乙酸 實驗步驟 1.用麗春紅 S 染液浸沒轉移后的膜，輕搖 5 min。 2.棄去染液，用水清洗膜，重復幾次，直到蛋白質條帶變得清晰。 不要重復使用染料，因為這可能使結