酵母雙雜交系統
· Yeast Two-Hybrid System (Finley Lab)This is one of the most comprehensive and detailed guide to yeast two-hybrid system technique with introduction to its background. The following procedures are described: mating assay - small scale for tens of different bait or prey proteins, collecting bait (and prey) strains, large scale for hundreds of different bait or......閱讀全文
雙雜交和其他雙成分系統實驗(三)
第三階段? 陽性相互作用的再次確定材料緩沖液和溶液乙酸銨（7.5 ml/L)氯仿乙醇異丙醇裂解液酶解酶 100T 以 2~5 mg/ml 溶解于拯救緩沖液中或β-葡糖醛酸酶 100000 單位/ml(Sigma）按 1:50 稀釋于拯救緩沖液中每次使用均需配置新鮮的溶液。酚（早衡至 pH8.0)拯救
雙雜交和其他雙成分系統實驗（一）
實驗材料 載體和酵母菌試劑、試劑盒 緩沖液和溶液SDS 凝膠上樣緩沖液SDS 聚丙烯酰胺凝膠核酸和寡核苷酸抗體培養基儀器、耗材 專用設備實驗步驟 第一階段 ?誘餌-LexA 融合蛋白的鑒定材料緩沖液和溶液將貯存液稀釋到適當濃度。2XSDS 凝膠上樣緩沖液100 mmol/L Tris-Cl(pH6.
雙雜交和其他雙成分系統實驗（二）
方法誘餌-LexA 融合蛋白的構建1.將編碼誘餌蛋白的靶 DNA 克隆到 LexA 融合載體（如，pMW101 或 pMW103) 的多聚接頭處，以合成一種框架內的 LexA 融合基因。確定誘餌序列的羧基端存在翻譯終止序列。形成的質粒作為 pBait。2. 采用下列 LexA 融合基因和報道質粒的組
雙雜交和其他雙成分系統實驗（三）
方法轉化文庫1. 挑選一個在第一階段的原始對照試驗中狀態最好的表達誘餌蛋白和 lexAop-lacZ 報道子的酵母菌落，接種于 20 ml CM(Glu)-Ura-His 液體培養基中，30°C 搖動過夜培養。重要：應該在用文庫重新轉化之前 7~10d 內，將誘餌蛋白和 lexAop-lacZ 報道
雙雜交和其他雙成分系統實驗（四）
21. 測定轉錄活化。這個實驗可以利用牙簽重新劃線培養或利用多支管/蛙形器來進行，在分析大量陽性克隆時，多支管/蛙形器是非常有用的（有關蛙形器的詳細情況請參見圖 18-10)。1) 通過直接劃線培養測定a. 使用一個平頭牙簽分別在下面的 4 個平板上復制和主板上相同的柵格。使用相同的牙簽在四個平板上
雙雜交和其他雙成分系統實驗（五）
離心機和轉子Sorvall RT6000 離心機，H1000B MPC 和 H6000A MPC 轉子（離心微量滴定板用）專用設備玻璃珠（直徑 0.45 mm, 無菌；Sigma)微量滴定板（24 孔或 96 孔 [可選])重復用移液管可選，請參見步驟 1。附加試劑此方案的步驟 2 需要第 1 章方
甲醇酵母基因表達系統
1 甲醇酵母表達系統的特點 1.1 宿主 七十年代巴斯德畢赤酵母曾被用于生產單細胞蛋白（SCP），有很好的發酵基礎，菌體密度可達100g/L干重。其生長培養液的組分包括無機鹽、微量元素、生物素、氮源和碳源，廉價而無毒。它能在以甲醇為唯一碳源的培養基中快速生長，其中醇氧化酶AOX——甲醇代謝途徑
畢赤酵母表達系統能在釀酒酵母里表達么
不太可能，Invitrogen的商業化畢赤酵母表達系統屬于甲醇酵母表達系統，用的是畢赤酵母獨有的AOX1啟動子，由甲醇誘導；釀酒酵母用的啟動子大多用的是GAPDH或Gal啟動子等，由葡萄糖和半乳糖誘導。雖然兩種菌株有很多基因具有較高的同源性，但不能通用。建議使用畢赤酵母表達系統，釀酒酵母表達量低，誘
關于酵母表達系統的概述
酵母表達系統作為一種后起的外源蛋白表達系統，由于兼具原核以及真核表達系統的優點，正在基因工程領域中得到日益廣泛的應用，應用此系統可高水平表達蛋白，且具有翻譯后修飾功能，故被認可為一種表達大規模蛋白的強有力的工具。
SW480－[SW480]－人結腸腺癌細胞－酵母雙雜交實驗常見問題
?SW480 [SW-480]?人結腸腺癌細胞 ?酵母雙雜交實驗常見問題?1.如果誘餌蛋白對酵母細胞是有毒的，該怎么辦？?在某些情況下，在液體培養基中培養不好的菌珠可以在固體培養基上生長得很好。首先重懸克隆于1ml的SD/–Trp，接著將重懸液平鋪于5 個100-mm的SD/–Trp平板，在30℃下
NCIN87－[N87]人胃癌細胞－酵母雙雜交實驗常見問題
NCI-N87 [N87]人胃癌細胞?酵母雙雜交實驗常見問題?1.如果誘餌蛋白對酵母細胞是有毒的，該怎么辦？?在某些情況下，在液體培養基中培養不好的菌珠可以在固體培養基上生長得很好。首先重懸克隆于1ml的SD/–Trp，接著將重懸液平鋪于5 個100-mm的SD/–Trp平板，在30℃下溫浴，直至平
現有技術水平蛋白質水平上研究基因功能的技術有哪些
隨著分子生物學技術的開展，對生物基因組中包含的全部基因及其所翻譯的蛋白質的功用加以解讀和描繪，特別是大量未知基因的功用及其相應蛋白質產物的功用停止研討成了基因工程研討的熱點方向。而在蛋白質程度上定量、動態、整體性研討生物體的蛋白質組學，將在后基因組時期大大促進我們對基因功用的了解。酵母雙雜交實驗
常用的酵母表達系統的介紹
酵母表達系統作為一種后起的外源蛋白表達系統，由于兼具原核以及真核表達系統的優點，正在基因工程領域中得到日益廣泛的應用，應用此系統可高水平表達蛋白，且具有翻譯后修飾功能，故被認可為一種表達大規模蛋白的強有力的工具。 常用的酵母表達系統： 一、釀酒酵母(Saccharomycescerevisi
Pichia酵母表達系統操作方法
我先說我有的質粒和菌株：PPIC9K，PPIC9，PPICZahphaA，B，C以及一個改造的PPIC9K載體，EcoRI和BamHI雙酶切，C末端引入了一個6histag菌株：GS115，KM71，X33，以及十幾個空載體對照菌株我的酵母表達Protocol：>10ug質粒用Sal線性化，加1/1
簡述甲醇營養型酵母表達系統
甲醇酵母表達系統是應用最廣泛的酵母表達系統。甲醇酵母主要有漢森酵母屬(Hansenula)，畢赤酵母屬(Pichia)，球擬酵母屬(Torulopsis)等，并以畢赤酵母屬(Pichia)應用最多。 甲醇酵母的表達載體為整合型質粒，載體中含有與酵母染色體中同源的序列，因而比較容易整合入酵母染色
畢赤酵母表達系統的特點
自從1987年Cregg等首次用巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）作為宿主表達外源蛋白以來,作為一種新的高效的表達系統，畢赤酵母越來越引起人們的重視，到1995年，已有四十多種外源蛋白在該宿主菌中獲得表達。而最近幾年每年報道的在畢赤酵母中表達的外源基因就有幾十種，且一年比一年多，與其它
蛋白質組的分析鑒定方法主要有哪些
為探究生物進程的分子機制,需要確定介導這個過程的蛋白質-蛋白質間的相互作用.研究蛋白質間相互作用的主要技術總結如下：一、酵母雙雜交系統酵母雙雜交系統是當前廣泛用于蛋白質相互作用組學研究的一種重要方法.其原理是當靶蛋白和誘餌蛋白特異結合后,誘餌蛋白結合于報道基因的啟動子,啟動報道 基因在酵母細胞內的表
蛋白質組學主要包括哪些分析技術及各自特點
為探究生物進程的分子機制，需要確定介導這個過程的蛋白質-蛋白質間的相互作用。研究蛋白質間相互作用的主要技術總結如下：一、酵母雙雜交系統酵母雙雜交系統是當前廣泛用于蛋白質相互作用組學研究的一種重要方法。其原理是當靶蛋白和誘餌蛋白特異結合后，誘餌蛋白結合于報道基因的啟動子，啟動報道 基因在酵母細胞內的表
CHO細胞表達系統與酵母細胞表達系統比較
?CHO細胞表達系統與畢赤酵母表達系統是當前發展前景看好的兩個表達系統，為了能夠更加直觀地對兩個表達系統有一定的認識，特意在此篇中對兩個表達系統作一定的比較，從而能夠更進一步的對兩個表達系統有更深的了解1．CHO細胞表達系統? ?? ??（1）優點? ?? ? CHO細胞屬于成纖維細胞，既可以貼壁生
畢赤酵母系統具有哪些優點
畢赤酵母系統的優點：（1）、擁有目前調控機理嚴格的啟動子之一醇氧化酶基因AOX1啟動子，非常利于外源基因的表達調控【1】；（2）、具有翻譯后的蛋白加工修飾功能例如磷酸化、糖基化等，是一種聚集多種又是的真核表達系統；（3）、既可以在細胞內表達，也可在細胞外表達；（4）、外源基因可以單拷貝或多拷貝的形式
關于甲醇酵母表達系統的基本介紹
甲醇酵母基因表達系統是一種最近發展迅速的外源蛋白質生產系統。甲醇酵母是可利用甲醇作為唯一碳源的酵母，主要有H.Polymorpha、Candida Bodinii、Pichia Pastoris三種，其中Pichia Pastoris作為基因表達系統使用得最多、最廣泛。與以往的基因表達系統相比，
甲醇酵母表達系統的高效表達特性
已有多種蛋白質的基因在該表達系統中克隆成功，包括蛋白酶、酶抑制劑、受體、單鏈抗體等。盡管各種外源蛋白質產生的水平不一，但各種蛋白質在甲醇酵母中的產生水平均為在細菌、昆蟲或哺乳動物等表達系統中產量的10～100倍[2]。如表皮生長因子（EGF）在釀酒酵母中的產量為7.4mg/L，而在甲醇酵母中為4
簡述甲醇酵母表達系統的應用前景
經過近幾年的發展完善，甲醇酵母表達系統已日趨成熟，應用也日趨廣泛。國內已有多篇在甲醇酵母中生產外源蛋白質成功的報道。美國Invitrogen公司也已開發出多種新型的甲醇酵母表達系統試劑盒，如Multi-copy Pichia Expression Kit、Easyselect Pichia Ex
關于釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)表達系統的介紹
釀酒酵母(Saecharomycescerevisiae)在釀酒業和面包業的使用已有數千年的歷史，被認為是GRAS(generally recognized as safe)生物，不產生毒素，已被美國FDA確認為安全性生物，但釀酒酵母難于高密度培養，分泌效率低，幾乎不分泌分子量大于30 kD的外
利用雙雜交系統相互作用阱／篩選特定蛋白肽適配體實驗
實驗材料DNA酵母株試劑、試劑盒PCR 引物聚乙二醇甘油存儲液Tris·ClX-gal 平板完全極限（CM） 缺失成分培養基和平板儀器、耗材30℃ 和 42℃ 培養箱或水浴實驗步驟實驗所需「材料」、「試劑」、「耗材」具體見「其他」1. 使用標準的亞克隆技術，將編碼誘餌蛋白的 DNA 插入 PEG20
利用雙雜交系統相互作用阱／篩選特定蛋白的肽適配體...
利用雙雜交系統相互作用阱／篩選特定蛋白的肽適配體實驗實驗方法原理 實驗材料 DNA酵母株試劑、試劑盒 PCR 引物聚乙二醇甘油存儲液Tris·ClX-gal 平板完全極限（CM） 缺失成分培養基和平板儀器、耗材 30℃ 和 42℃ 培養箱或水浴實驗步驟 實驗所需「材料」、「試劑」、「耗材」具體見「其
甲醇酵母系統表達的影響因素1
酵母菌是單細胞真核生物，具有生長快、易于遺傳操作、能對外源蛋白進行翻譯后加工和修飾、不產生有毒產物等特點，被認為是表達外源蛋白的合適宿主。幾種工業酵母尤其是巴氏畢赤酵母(pichia pastoris, Pp)，因具有旺盛的生長力以及其它一些獨特的性質，已發展成為較成熟的蛋白生產的表達系統。
甲醇酵母系統表達的影響因素3
甲醇誘導的方式、用量、誘導時間都會影響外源蛋白的表達水平。在誘導期間每天應往培養基中補加甲醇，以彌補甲醇的消耗和蒸發；但由于培養條件和轉化子表型不同，添加甲醇的量也有所不同，一般添加量為培養基體積的0.5％～1％。誘導時間過短則表達量很低，過長則外源蛋白的降解增加，應根據菌株的需要選擇合適的誘導時間
甲醇酵母系統表達的影響因素2
2、表達框的染色體整合位點和方式雖然相對于自主復制載體來講，整合性載體的轉化率較低，但由于Pp沒有天然質粒，所以設計表達載體偏向于染色體整合，通過同源重組，載體整合到細胞染色體中間。整合性載體具有表達框穩定和可控制整合位點等優越性，并且能夠發生多位點整合而獲得多拷貝。AOX1和組氨酸脫氫酶(hist
白色假絲酵母的系統的位置介紹
臨床真菌按其所致疾病的癥狀和體征進行分類，DYMD系統(皮膚真菌、酵母菌、真菌)這一分類模式已得到公認，是以組織發生學、生理學及形態學特征為基礎，將真菌分類為類酵母菌和絲狀真菌，又進一步按其組織親和性分別將它們分為皮膚真菌和真菌。對婦產科醫生來說，不同種類的真菌醫學相關性大不相同，迄今未發現由真