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Angerer及其同事們首先應用RNA探針于原位雜交（見Cox et al 1984），核酸探針為單鏈的RNA分子，產生自具有質粒逆轉錄系統的cDNA克隆（圖20-2）。由于它是單鏈的，不像雙鏈的DNA探針，在溶液中不會再退火（reanneal），因此，較大百分比的探針可參與雜交反應，較cDNA探針的信號強。除此之外，在溶液中產生的cRNA-mRNA雜交體比相應的cDNA-mRNA雜交體穩定，但在原位雜交中是否如此尚未證明。cRNA探針不足之處在于有時比DNA探針粘性強（stickier）。可與組織產生較高的非特異性結合，但此缺陷可在雜交后漂洗液中加用酶漂洗來解決。最近，Wolf等（1987）建議插入確定長度的寡核苷酸至載體內產生cRNA分子，這種cRBA分子稱為“寡核苷酸核酸探針”（oligoribo－probes）已被成功的用于原位雜交實驗。圖20-2 示cDNA轉錄為cRNA，可標記以不同的標記物，然后與細胞中的mRNA......閱讀全文
一、核酸分子雜交技術1961年Hall開拓了液相核酸雜交技術的研究，其基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基順序，通過堿基對之間非共價鍵的形成，出現穩定的雙鏈區，形成雜交的雙鏈。自此以后，由于分子生物學技術的迅猛發展，特別是70年代末到80年代初，分子克隆、質粒和噬菌體DNA的構建成功，核酸自動
一、核酸分子雜交技術1961年Hall開拓了液相核酸雜交技術的研究，其基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基順序，通過堿基對之間非共價鍵的形成，出現穩定的雙鏈區，形成雜交的雙鏈。自此以后，由于分子生物學技術的迅猛發展，特別是70年代末到80年代初，分子克隆、質粒和噬菌體DNA的構建成功，核酸自動
一、核酸分子雜交技術1961年Hall開拓了液相核酸雜交技術的研究，其基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基順序，通過堿基對之間非共價鍵的形成，出現穩定的雙鏈區，形成雜交的雙鏈。自此以后，由于分子生物學技術的迅猛發展，特別是70年代末到80年代初，分子克隆、質粒和噬菌體DNA的構建成功，核酸自動
DNA合成儀的誕生使制造寡核苷酸探針成為可能，與上述探針不同的是寡核苷酸探針不是克隆性DNA探針，它是由DNA合成儀依照所需雜交的靶核苷酸序列合成的。具有制造方便，價格低廉的優點，也可進行放射性與非放射性標記，但其特異性不如克隆性探針強，亦不如其雜交信號高。 原位雜交組織化學技術在近20年的發展
第一節 原位雜交組織化學概述 一、核酸分子雜交技術 1961年Hall開拓了液相核酸雜交技術的研究，其基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基順序，通過堿基對之間非共價鍵的形成，出現穩定的雙鏈區，形成雜交的雙鏈。自此以后，由于分子生物學技術的迅猛發展，特別是70年代末到80年代初，分子克隆、質
二、生物素標記cRNA探針在原位雜交組織化學中的應用 （一）光敏生物素標記cRNA探針的應用 以線性質粒DNA為模板合成未加標記物的cRNA探針，使其最終濃度為0.5～1.0μg/μl(500~1000ng/μl),再與等體積的光敏生物素（1μg/μl）混合。在150瓦鹵素燈下，距離光源20c
如前所述，雜交前的準備只是為雜交的成功奠定基礎，要獲得滿意的實驗結果，在雜交這一實驗過程中還須注意以下的環節。1．探針的濃度 很難事先確定每一種實驗探針的濃度，但要掌握一個原則，即探針濃度必須給予該實驗zui大的信/噪比值。背景染色的高低也與探針濃度有關。根據國內外實驗工作者的經驗，認為zui佳原
（四）雜交后處理（post hybridisation treatment） 雜交后處理包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。在原位雜交組織化學的實驗程序中，這也是一個重要的環節 。特別因為大多數的原位雜交實驗是在低嚴格度條件下進行的，非特異性的探針片段粘附在組織切片上，從而增強了背景染色。R
一、DNA探針的應用 雖然一般認為DNA探針敏感度不如cRNA探針，但在病毒的檢測等領域中DNA探針仍得到廣泛的應用。 在原位雜交細胞化學的操作步驟方面與cRNA探針基本相同，所不同的是：（1）雜交時需先在高溫80～95℃短時處理，使DNA探針及細胞內靶DNA變性，解離成單鏈，迅置于冰上冷卻。然
（8）熒光顯示： ①生物素標記DNA探針的熒光顯示。 1）應用PBS含5%無脂干奶（5μl每張蓋片），也可用1%牛血清白蛋白（BSA）-PBS覆蓋孵育5min室溫，以封閉非特異性結合部位。 2）移除多余液體，加抗生素-FITC（5μg/ml在PBS含5%奶粉或1%BSA，5μl/cm2）。在濕
二、快速原位雜交細胞化學技術 原位雜交免疫細胞化學技術存在的難點之一是實驗手續繁瑣，實驗周期長。國外Liesi等（1986）和國內學者何彬等應用光敏生物素-鏈親合素（Biotin-streptavidin）膠體金系統進行原位雜交，得到了快速滿意的結果，全部實驗可在數小時內完成。 作用把含某種多肽
（一）一般光學顯微鏡術應用一般光學顯微鏡（簡稱光鏡）觀察組織切片是組織學研究的最基本方法。取動物或人體的新鮮組織塊，先用固定劑（fixative）固定（fixation），使組織中的蛋白質迅速凝固，防止細胞自溶和組織腐敗。常用的固定劑如灑精、甲醛、醋酸、苦味酸、四氧化鋨等，一般常將幾種固定劑配制成混