原位雜交組織化學實驗技術2
DNA合成儀的誕生使制造寡核苷酸探針成為可能，與上述探針不同的是寡核苷酸探針不是克隆性DNA探針，它是由DNA合成儀依照所需雜交的靶核苷酸序列合成的。具有制造方便，價格低廉的優點，也可進行放射性與非放射性標記，但其特異性不如克隆性探針強，亦不如其雜交信號高。 原位雜交組織化學技術在近20年的發展可以說是飛躍的，其突出的特點是由分子遺傳學研究提供的探針大量增加，探針生產的可靠性和速率大大發展了，更重要的是非放射性標記物的發展使原位雜交組織化學技術在不久的將來將和現今的免疫細胞化學技術一樣成為實驗室的常規技術和臨床日常應用的診斷技術。新的非放射性標記技術正在繼續不斷涌現。Coulton（1991）建議將非放射性標記技術更名為親合復合物標記技術（Affinity – Complex Labelled Probes, ACLP ）。因為“非（non）“在英文里是一個否定的名詞，而且根據非放射性標記技術的原理是將一個標記物利用其親合性......閱讀全文
原位雜交組織化學實驗技術2
DNA合成儀的誕生使制造寡核苷酸探針成為可能，與上述探針不同的是寡核苷酸探針不是克隆性DNA探針，它是由DNA合成儀依照所需雜交的靶核苷酸序列合成的。具有制造方便，價格低廉的優點，也可進行放射性與非放射性標記，但其特異性不如克隆性探針強，亦不如其雜交信號高。 原位雜交組織化學技術在近20年的發展
原位雜交組織化學實驗技術1
第一節 原位雜交組織化學概述 一、核酸分子雜交技術 1961年Hall開拓了液相核酸雜交技術的研究，其基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基順序，通過堿基對之間非共價鍵的形成，出現穩定的雙鏈區，形成雜交的雙鏈。自此以后，由于分子生物學技術的迅猛發展，特別是70年代末到80年代初，分子克隆、質
原位雜交組織化學實驗技術4
二、生物素標記cRNA探針在原位雜交組織化學中的應用 （一）光敏生物素標記cRNA探針的應用 以線性質粒DNA為模板合成未加標記物的cRNA探針，使其最終濃度為0.5～1.0μg/μl(500~1000ng/μl),再與等體積的光敏生物素（1μg/μl）混合。在150瓦鹵素燈下，距離光源20c
原位雜交組織化學實驗技術5
（8）熒光顯示： ①生物素標記DNA探針的熒光顯示。 1）應用PBS含5%無脂干奶（5μl每張蓋片），也可用1%牛血清白蛋白（BSA）-PBS覆蓋孵育5min室溫，以封閉非特異性結合部位。 2）移除多余液體，加抗生素-FITC（5μg/ml在PBS含5%奶粉或1%BSA，5μl/cm2）。在濕
原位雜交組織化學實驗技術6
二、快速原位雜交細胞化學技術 原位雜交免疫細胞化學技術存在的難點之一是實驗手續繁瑣，實驗周期長。國外Liesi等（1986）和國內學者何彬等應用光敏生物素-鏈親合素（Biotin-streptavidin）膠體金系統進行原位雜交，得到了快速滿意的結果，全部實驗可在數小時內完成。 作用把含某種多肽
原位雜交組織化學實驗技術3
（四）雜交后處理（post hybridisation treatment） 雜交后處理包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。在原位雜交組織化學的實驗程序中，這也是一個重要的環節 。特別因為大多數的原位雜交實驗是在低嚴格度條件下進行的，非特異性的探針片段粘附在組織切片上，從而增強了背景染色。R
DNA實驗技術：原位雜交實驗要求及步驟2
三、操作步驟（一）取材、冰凍切片：將動物以3%戊巴比妥鈉麻醉，打開胸腔，暴露心臟，刺破右心耳，將針尖刺入左心室用生理鹽水灌注（灌注量約為動物體重的2倍），再注入等量的4%多聚甲醛。（見圖2-7）。取材，置于4%多聚甲醛中后固定4hr。以0.1M PBS浸泡沖洗4-5次（換液：1次/hr）。將組織塊入
原位雜交組織化學常用試劑及處理2
九、原位雜交信號顯示 目前應用原位雜交方法中，信號的顯示主要有放射自顯影，酶底物及免疫金銀等方法，在此歸納有關的主要試劑。 1．A-B顯影液 稱取上述試劑，按配方分別溶于50ml ddH2O中，于顯影前，在室溫將兩者（A液及B液）按1：1混合，稍加搖動促進混合，即可將貼有切片標本的切片放入顯影
原位雜交組織化學技術的基本方法
一、核酸分子雜交技術1961年Hall開拓了液相核酸雜交技術的研究，其基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基順序，通過堿基對之間非共價鍵的形成，出現穩定的雙鏈區，形成雜交的雙鏈。自此以后，由于分子生物學技術的迅猛發展，特別是70年代末到80年代初，分子克隆、質粒和噬菌體DNA的構建成功，核酸自動
原位雜交組織化學技術的基本方法
一、核酸分子雜交技術1961年Hall開拓了液相核酸雜交技術的研究，其基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基順序，通過堿基對之間非共價鍵的形成，出現穩定的雙鏈區，形成雜交的雙鏈。自此以后，由于分子生物學技術的迅猛發展，特別是70年代末到80年代初，分子克隆、質粒和噬菌體DNA的構建成功，核酸自動
原位雜交組織化學實驗要求及步驟
一、基本要求1. 組織取材：組織取材應盡可能新鮮。由于組織RNA降解較快，所以新鮮組織和培養細胞最好在30 min 內固定。2. 固定目的是：（1）保持細胞結構；（2）最大限度地保持細胞內DNA或RNA的水平；（3）使探針易于進入細胞或組織。最常用的固定劑是多聚甲醛，與其它醛類固定劑（如戊二醛）不同
原位雜交組織化學技術的基本方法（二）
如前所述，雜交前的準備只是為雜交的成功奠定基礎，要獲得滿意的實驗結果，在雜交這一實驗過程中還須注意以下的環節。1．探針的濃度 很難事先確定每一種實驗探針的濃度，但要掌握一個原則，即探針濃度必須給予該實驗zui大的信/噪比值。背景染色的高低也與探針濃度有關。根據國內外實驗工作者的經驗，認為zui佳原
原位雜交組織化學概述
一、核酸分子雜交技術1961年Hall開拓了液相核酸雜交技術的研究，其基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基順序，通過堿基對之間非共價鍵的形成，出現穩定的雙鏈區，形成雜交的雙鏈。自此以后，由于分子生物學技術的迅猛發展，特別是70年代末到80年代初，分子克隆、質粒和噬菌體DNA的構建成功，核酸自動
熒光原位雜交實驗——熒光原位雜交技術
熒光原位雜交可應用于：（1）動植物基因組結構研究；（2）染色體精細結構變異分析；（3）病毒感染分析；（4）腫瘤遺傳學和基因組進化研究。實驗方法原理用已知的標記單鏈核酸為探針，按照堿基互補的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進行異性結合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱
電鏡原位雜交技術實驗
實驗方法原理?從理論上講，前包埋原位雜交技術的敏感性高于后包埋原位雜交技術，因為前者可觀察到來自整個切片厚度的信號。但是，探針并不一定能穿透整個切片厚度，特別是用較長的探針。為了增加穿透性，經常應用凍融法或者蛋白酶和去污劑處理，而這樣做會導致一些胞內成分如核糖體的丟失，嚴重時會造成超微結構的形態改變
電鏡原位雜交技術實驗
電鏡原位雜交實驗可以用于：（1）研究特定核苷酸序列的亞細胞定位；（2）許多研究者已經從光學顯微觀察擴展到對超微結構的觀察。（3）特別是利用地高辛或生物素作為報告分子的非放射性探針，不必像放射性探針那樣需要長時間暴露，因此整個過程可以在 24 h 內完成。實驗方法原理從理論上講，前包埋原位雜交技術的敏
電鏡原位雜交技術實驗
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 從理論上講，前包埋原位雜交技術的敏感性高于后包埋原位雜交技術，因為前者可觀察到來自整個切片厚度的信號。但是，探針并不一定能穿透整個切片厚度，特別是用較長的探針。為了增加穿透性，經常應用凍融法或者蛋白酶和去污劑處理，而這樣做會導致
cRNA探針在原位雜交組織化學
Angerer及其同事們首先應用RNA探針于原位雜交（見Cox et al 1984），核酸探針為單鏈的RNA分子，產生自具有質粒逆轉錄系統的cDNA克隆（圖20-2）。由于它是單鏈的，不像雙鏈的DNA探針，在溶液中不會再退火（reanneal），因此，較大百分比的探針可參與雜交反應，較cDNA探針
原位雜交組織化學雜交體檢測
? ?雜交體檢測又稱雜交體顯示，是指通過一定方法使雜交反應形成的雜交體（雜交信號）成為在顯微鏡下可識別的產物。對原位雜交反應信號進行顯示的方法因探針標記物不同而異。?? ?（一）放射性核素標記探針的檢測??? *個原位雜交實驗（1969年）以’H作為核酸探針的標記物，雜交信號用放射自顯影術檢測。隨著
原位雜交組織化學雜交前處理
雜交前處理的目的在于提高組織通透性。增加靶核酸的可及性以及防止RNA或DNA探針與組織細胞或載玻片之間的非特異性結合，從而增強雜交信號，降低背景。雜交前處理的具體方法和步驟因所采用的固定劑、組織標本以及探針不同而異。用溫和的非交聯固定劑固定的細胞培養標本和冰凍切片，不需經特殊的雜交前處理，一般均能獲
熒光原位雜交技術實驗心得
熒光原位雜交技術（ fluorescence in situ Hybridization,FISH）是一種非放射性原位雜交方法，用特殊的熒光素標記核酸探針，在細胞或組織切片標本上進行雜交，以檢測細胞內 DNA 或 RNA 特定序列存在與否。FISH 實驗操作與用非熒光標記探針的原位雜交基本相似。在組
原位雜交組織化學常用試劑及處理
一、雜交前準備 （一）DEPC水是經DEPC處理過的滅菌蒸餾水。 DEPC即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可滅活各種蛋白質，是RNA酶的強抑制劑。原位雜交在雜交及其以前的各步處理中，所有液體試劑都應經DEPC處理。方法是：取市售DEPc 1ml，加入1L待處理水（蒸餾
DNA實驗技術：原位雜交實驗要求及步驟1
原位雜交組織（或細胞）化學 （In situ Hybridization Histochemistry，ISHH） 簡稱原位雜交（In Situ Hybridization），屬于固相分子雜交的范疇，它是用標記的DNA或RNA為探針，在原位檢測組織細胞內特定核酸序列的方法。根據所用探針和靶核酸的不同
免疫組織化學技術實驗標本介紹
實驗所用主要為組織標本和細胞標本兩大類，前者包括石蠟切片（病理切片和組織芯片）和冰凍切片，后者包括組織印片、細胞爬片和細胞涂片。其中石蠟切片是制作組織標本最常用、最基本的方法，對于組織形態保存好，且能作連續切片，有利于各種染色對照觀察；還能長期存檔，供回顧性研究；石蠟切片制作過程對組織內抗原暴露有一
原位雜交技術
導語我們常說，科學家也是藝術家，在明確真理探索科學的道路上，往往會創造出很多極具美感的藝術作品。所以今天小編為大家介紹的就是能做出美美圖的新技能。先欣賞一下美美的實驗結果圖~---Olson, B. D. and Downes, G. B.?---in situ Hybridization of w
原位雜交儀—原位雜交實驗（二）
原位雜交第二天 1. 1）將探針回收，放于－20C保存（通常探針可重復使用十次左右）。 2）加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升，60℃，放置30分鐘，重復一次。 3）置換2XSSCT1ml，60℃，放置15分鐘。 4）置換0.2XSSCT1ml，60℃，放置30分鐘，重復一次。
原位雜交儀—原位雜交實驗（三）
原位雜交第三天 1） 用1ml含10%熱滅活血清的MABT溶液置換抗體溶液，放置搖床上25分鐘，然后用1mlMABT置換，25分鐘，再用1mlMABT溶液置換，一小時以上，最后用1mlMABT溶液置換，25分鐘。 2） 用1ml 1mM左旋米睉的Staining buffer洗三次，每次放置
動物實驗技術2
2．于第①、②、③管內分別加乙型溶血性鏈球菌培養物、四聯球菌培養物、生理鹽水各0.5m1。 3．上述3支試管每管加入5%氯化鈣0.2ml，搖勻，置37℃水浴10min，待血液凝固，再繼續37℃水浴約30min，觀察結果。 【結果】 l．觀察時，可將小試管慢慢傾斜至30°
培養神經元原位雜交技術實驗
原位雜交（inhybridization,ISH) 的目的是在細胞結構內顯 TKmRNA 分子。在 ISH 步驟中要采用高溫，這就對細胞的固定有特殊要求。如果原位雜交方法不能提供陽性的雜交信號，還可以應用其他的技術，如通過 mRNA 擴增來檢測神經突起微小區域內的低豐度 mRNA 的存在（Miyas
培養神經元原位雜交技術實驗
實驗方法原理 流程圖實驗材料 溶液和緩沖液原位雜交試劑、試劑盒 RNA 聚合酶地高辛-UTP 標記混合物實驗步驟 一、制備地高辛標記的探針將 cDNAs 克隆入 pBluescript 載體中。為了能在體外轉錄，質粒需經線性化或 PCR 然后根據插入 cDNA 的方向應用 T3 或 T7RN