在質粒載體中進行平末端片段的克隆實驗
在質粒載體中進行平末端片段的克隆實驗 實驗方法原理 克隆平末端的目的片段時，為最大量地獲得“正確”的連接產物，載體和目的 DNA 在連接反應中的比例必須適當。每一重組體中外源 DNA 的連接方向和插入數量都必須用限制酶酶切圖譜分析或其他方法加以鑒定。作為一般規律，如果連接反應中質粒和目的 DNA 摩爾數相等，而且 DNA 的總濃度少于 100 μg/ml，獲得一定數量的單體閉合重組子是可能的 ( Bercovich et al. 1992)。 實驗材料 T4 噬菌體 DNA 連接酶 限制性內切核酸酶 ......閱讀全文
質粒與載體
一、質粒絕大多數的生物都是以DNA 的形式來儲藏其遺傳信息。遺傳物質要能生生不息地傳給后代的首要條件就是它至少要具有一個復制原(ori, origin of replication，或譯為復制起點)，使整個基因體得以復制。含有復制原的遺傳物質稱為replicon，我們姑且把它譯為為復制體吧！原核性復
什么是質粒載體？
質粒載體是在天然質粒的基礎上為適應實驗室操作而進行人工構建的質粒。與天然質粒相比，質粒載體通常帶有一個或一個以上的選擇性標記基因（如抗生素抗性基因）和一個人工合成的含有多個限制性內切酶識別位點的多克隆位點序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量盡可能減少，以便于基因工程操作。
質粒載體的分類
按復制形式分為嚴緊型和松弛型復制。根據質粒DNA復制與宿主之間的關系或在宿主細胞的拷貝數的多少，可以將質粒分為兩種不同的復制類型：嚴緊型和松弛型。嚴緊型質粒復制受宿主染色體DNA復制的嚴格控制，拷貝數較小一般只有1~3個拷貝。疏松型質粒的復制宿主的控制比較松，在宿主中的拷貝數比較多，一般有10~20
pUC質粒載體結構
（1）來自于pBR322的Ori（2）氨芐青霉素的抗性基因(ampr)。 但核苷酸序列發生了變化（3） LacZ′基因編碼β—半乳糖酶的α—肽鏈即氨基末端。（4）MCS區段是一段用于插入外源DNA片段的特定區域，由一系列的緊密相連的限制性內切酶位點組成，而且每個限制性內切酶位點在整個載體中是唯一的。
質粒載體的載體大小的介紹
大的質粒（大于15kb）不會很好轉化而且DNA產量通常很低。在設計實驗時要考慮到加入插入片段的最終載體大小，盡量用更小的載體。 兼容性 當多于一個質粒載體必須同時存在于同一個細菌細胞中，這兩個質粒的復制子必須是兼容的。當他們不能穩定地共存時，則認為這兩個質粒是不兼容的。 選擇/檢測插入片段
簡述慢病毒載體的載體質粒
載體質粒上HIV-1的順式序列通常包括兩端的LTR、剪切位點及包裝信號Ψ等。此外，研究表明，gag基因5′端的序列可提高載體RNA的包裝效率；Rev蛋白需要與Rev反應元件(RRE)相作用，將未剪切的載體轉錄產物從細胞核轉運到胞漿。因此，Naldini等在載體上保留了gag基因5′端350bp的
關于質粒載體的簡介
質粒是小型環狀DNA分子,大小為1～200kb(1kb=1000堿基對)。質粒不同于病毒,是裸露的DNA分子,沒有外殼蛋白,在基因組中,也沒有溶菌酶基因。質粒在宿主細胞內才能完成自身復制,同時將編碼的一些非染色體控制的遺傳性狀進行表達,賦予宿主細胞一些額外的特性,包括抗性特性、代謝特性等,其中對
酵母質粒載體的特點
酵母質粒載體既可以在大腸桿菌復制與擴增、又可以在酵母系統中復制與擴增,故此類載體又稱為穿梭載體(shuttlevector)。 在基因工程中,應用上述病毒表達載體在哺乳動物細胞中進行中、小規模的表達是十分實際的。還要有對組織培養技術十分熟悉的前提。但病毒載體的運用仍然存在技術較難、耗時間和不經
酵母質粒載體的特點
酵母質粒載體既可以在大腸桿菌復制與擴增、又可以在酵母系統中復制與擴增，故此類載體又稱為穿梭載體(shuttlevector)。在基因工程中，應用上述病毒表達載體在哺乳動物細胞中進行中、小規模的表達是十分實際的。還要有對組織培養技術十分熟悉的前提。但病毒載體的運用仍然存在技術較難、耗時間和不經濟的問題
質粒載體的改造意義
⑴去掉不必要的DNA區段。⑵減少限制酶的識別位點，一種酶只保留一個。（單一的限制性酶切位點）。⑶加入易于撿出的選擇性標記基因。⑷對質粒進行安全性改造，要求質粒不能隨便 轉移。⑸改造或增加基因表達的調控序列。
質粒載體連接反應
連接反應（一）外源ＤＮＡ和質粒載體的連接反應 外源ＤＮＡ片段和線狀質粒載體的連接，也就是在雙鏈ＤＮＡ５'磷酸和相鄰的3'羥基之間 形成的新的共價鏈。如質粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成４個新的磷酸二酯鏈。但如果質粒ＤＮＡ已去磷酸化，則吸能形成２個新的磷酸二酯鏈。在這種情況
關于質粒載體的基本介紹
質粒是小型環狀DNA分子，在基因工程中作為最常用，最簡單的載體，必須包括三部分：遺傳標記基因，復制區，目的基因。 質粒在所有的細菌類群中都可發現，它們是獨立于細菌染色體外自我復制的DNA分子。自然界中，質粒是在營養充足時出現的，它在結構、大小、復制方式，每個細菌的拷貝數，在不同的細菌體內的繁殖力
質粒載體的篩選特征介紹
選擇質粒載體的要素是要了解可用到的載體的特征和預測重組克隆所用于的實驗。 所有的質粒載體都有三個共同的特征：一個復制子、一個選擇性標志和一個克隆位點。復制子是含有DNA復制起始位點的一段DNA（ori），也包括表達由質粒編碼的復制必需的RNA和蛋白質的基因。選擇性標志對于質粒在細胞內持續存在時
柯斯質粒載體的特性
1、具有l噬菌體的特性 柯斯質粒連接上適宜長度的外源DNA后可以在體外包裝成噬菌體顆粒，并能高效轉導寄主細胞。進入寄主細胞的DNA也能環化和復制，但是不會形成新的噬菌體顆粒，也不能發生溶菌現象。2、具有質粒載體的特性 能象質粒一樣在寄主細胞內復制，且帶有抗性選擇標記基因，有些還帶有插入失活型的多克隆
柯斯質粒載體的特點
柯斯質粒是一類人工構建的含有lDNA的cos序列和質粒復制子的特殊類型的質粒載體，cosmid是cos site carrying plasmid的縮寫。柯斯質粒的大小為4-6kb，由3部分組成：A.多克隆位點區B. 含有cos位點的lDNA區C. 復制起始位點和抗性標記區
常用的質粒載體有哪些
載體種類：質粒、噬菌體、腺病毒載體、逆轉錄病毒載體質粒特點：存在于細菌染色體外的小型環狀DNA分子。具有自我復制功能。帶有抗性基因及表型識別等遺傳性標記物。經改造后具有多克隆位點。舉例：pMD-18T質粒、pUCl9質粒、pBR322質粒等
簡述質粒載體具備的條件
質粒載體絕大多數是以天然質粒為基礎,加以人工改造和組建。理想的細菌質粒載體,除去其他類型載體相同的特點外,還應具備以下條件： ①相對分子質量盡可能小,質粒越小,拷貝數越高,而且便于提取和純化； ②DNA結構和功能清楚,質粒序列中具有包含一系列單一限制酶酶切位點的多克隆位點,便于帶有不同末端的
關于質粒載體的特點簡介
質粒（plasmid）是細菌或細胞染色質以外的，能自主復制的，與細菌或細胞共生的遺傳成分。其特點如下： 是染色質外的雙鏈共價閉合環形DNA （covalently closed circular DNA,cccDNA），可自然形成超螺旋結構，不同質粒大小在2-300kb之間，15kb的大質粒
質粒載體的基本特征
質粒（plasmid）是細菌或細胞染色質以外的，能自主復制的，與細菌或細胞共生的遺傳成分。其特點如下：是染色質外的雙鏈共價閉合環形DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA），可自然形成超螺旋結構，不同質粒大小在2-300kb之間，15kb的大質粒則不易提取。
關于質粒載體的分類介紹
按復制形式 分為嚴緊型和松弛型復制。 根據質粒DNA復制與宿主之間的關系或在宿主細胞的拷貝數的多少，可以將質粒分為兩種不同的復制類型：嚴緊型和松弛型。嚴緊型質粒復制受宿主染色體DNA復制的嚴格控制，拷貝數較小一般只有1~3個拷貝。疏松型質粒的復制宿主的控制比較松，在宿主中的拷貝數比較多，一般
LITMUS39載體載體載體的基本信息和質粒圖譜
LITMUS39載體載體基本信息載體名稱LITMUS39載體抗性Ampicillin載體長度2817 bp載體類型Basic Cloning Vectors載體來源Evans PD, Cook SN, Riggs PD, Noren CJ.拷貝數High copy number5'引物M13
酵母質粒載體的概念和分類
酵母質粒載體是基因表達載體的一種，既可以在大腸桿菌中、又可以在酵母系統中進行復制與擴增，所以也稱為穿梭載體。它分為整合載體和自我復制載體兩類。①整合載體：它帶有一個酵母URA3標志基因和大腸桿菌的復制和報告基因。②自我復制載體：該類載體在酵母中可以自我復制。
關于黏性質粒載體的簡介
由于真核基因的結構與功能研究的需要，人們發展出比λ噬菌體載體具有更大克隆能力的新型的載體——柯斯質粒載體(cosmid vectors，cosmid是COS site—carrying plasmid的縮寫)，也稱為黏陛質粒或黏粒。這是一類人工構建的含有抗性基因、單一克隆位點以及λDNACOS位
自殺性質粒載體的構建
自殺性質粒載體完全可以自己構建，只要保證兩點：１，自殺性質粒載體不能在你的宿主菌里進行復制，也就是說載體上不能有能在宿主菌中復制的復制子；２，要由篩選標記．?自殺性質粒載體不能在你的宿主菌里進行復制，否則會導致細菌染色體突變株的構建失敗。但是在構建時，要注意以下方面：1。在制備質粒載體和DNA插入片
理想的質粒載體條件是什么
1、 理想的質粒載體條件：具有復制起始點。具有兩種以上易被檢測的選擇性標記。在選擇標記上具有多種限制酶的單一切點。具有盡可能小的相對分子質量。應屬于松弛復制型。應為非傳遞性質粒理想值粒載體。2、例子： pBR22質粒載體：相對分子質量較小具有一個復制起始點，屬松弛復制性載體。含四環素抗性和氨芐青霉素
關于酵母質粒載體的基本介紹
酵母質粒載體是基因表達載體的一種,既可以在大腸桿菌中、又可以在酵母系統中進行復制與擴增,所以也稱為穿梭載體。它分為整合載體和自我復制載體兩類。 ①整合載體：它帶有一個酵母URA3標志基因和大腸桿菌的復制和報告基因。 ②自我復制載體：該類載體在酵母中可以自我復制。
篩選質粒載體構建表達文庫實驗
? ? ? ? ? ? 試劑、試劑盒 封閉緩沖液 氯仿 裂解緩沖液 檢測抗原-抗體復合物所用試劑 SM TNT 緩沖液 洗滌緩沖液
篩選質粒載體構建表達文庫實驗
檢測結合抗體的方法有以下 3 種：放射化學篩選，生色反應篩選及化學發光反應篩選。3 種方法的優缺點在本章導言中有所論述。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，作者：〔美〕J. 薩姆布魯克 D.W. 拉塞爾。試劑、試劑盒封閉緩沖液氯仿裂解緩沖液檢測抗原-抗體復合物所用試劑SMTNT 緩沖液洗滌緩
篩選質粒載體構建表達文庫實驗
試劑、試劑盒 封閉緩沖液氯仿裂解緩沖液檢測抗原-抗體復合物所用試劑SMTNT 緩沖液洗滌緩沖液 125I 標記的蛋白質 A 或 125I 標記的免疫球蛋白放射性碘化第二抗體第一抗體LB 或 SOB 瓊脂平板儀器、耗材 空氣培養箱平頭鑷子 裝有防水黑墨水（印度墨水）并帶有 18 號針頭的注射器硝酸纖維
酵母質粒載體具備的條件有哪些？
一個理想的基因載體應該具有以下幾個基本條件： ①能在宿主細胞進行獨立和穩定的DNA自我復制,并在其DNA中插入外源基因后,仍然保持著穩定的復制狀態和遺傳特性； ②易于從宿主細胞中分離,并進行純化； ③在其DNA序列中,具有適當的限制性內切酶位點(最好是單一酶切位點)。這些位點位于DNA復制