cDNA文庫構建
實驗方法原理 cDNA 文庫是指某生物某發育時期所轉錄的全部 mRNA 經反轉錄形成的 cDNA 片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。經典 cDNA 文庫構建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆轉錄引物，或者用隨機引物，給所合成的 cDNA 加上適當的連接接頭，連接到適當的載體中獲得文庫。其基本步驟包括：（1）mRNA的提純獲取高質量的mRNA是構建高質量的cDNA文庫的關鍵步驟之一。（2）cDNA第一條鏈的合成。（3）cDNA第二條鏈的合成。（4）雙鏈cDNA的修飾。（5）雙鏈cDNA的分子克隆。（6）cDNA文庫的擴增。（7）cDNA文庫鑒定評價 實驗材料 mRNA試劑、試劑盒 DTT蒸餾水dNTPEDTASDS乙醇聚合酶瓊脂糖DNA聚合酶BSAT4 DNA連接酶酚氯仿異戊醇PCR純化試劑盒儀器、耗材 制冰機離心機水浴鍋電泳儀離心管移液槍培養箱實驗步驟 一、Superscipt II—RT合成第一鏈&nbs......閱讀全文
怎樣去除cDNA文庫構建過程中的核糖體RNA
反轉錄結束后，加RNase處理
cDNA文庫的物化方法
基因工程初始階段所用的方法，已不用。利用核酸雙螺旋之間存在著堿基G C，A T配對特性，分離目的基因。 例如：海膽rDNA分子內其G C含量可以達63%（其穩定性高，溶解溫度高），通過熱變性和S1酶解處理可得到提純50倍的rDNA，最后經氯化銫平衡梯度離心，得到相對分子量為1.9X107Dal
差減cDNA文庫法
差減cDNA文庫法[第一條鏈cDNA合成]1．合成第一條cDNA鏈時，所有試劑應按下列順序依次加入：10×第一條鏈合成緩沖液?????????????????5.0μl10mM dNTP Mix(1.4μg/μl)???????????????2.5μl(終濃度1.25mM)Linker prime
關于cDNA文庫的簡介
cDNA文庫（cDNA library）：是指某生物某一發育時期所轉錄的mRNA全部經反轉錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。 cDNA文庫是以特定的組織或細胞mRNA為模板，逆轉錄形成的互補DNA（cDNA）與適當的載體（常用噬菌體或質粒載體）連接后轉化受體菌形成重組DNA
cDNA文庫組標準流程6
2．pBlueScriptII的雙酶切消化 1．以如下體系進行EcoRI酶切： pBSK(+) X μl（6μg） ddH2O 174-X μl 10×Buffer E 20 μl 混勻，加入限制性內切酶： EcoRI （10U/ μl） 6 μl 總體積為200 μl。 2．輕彈管壁或用槍頭輕輕吹
cDNA文庫組標準流程4
三．cDNA雙鏈合成1.SupersciptII —RT合成第一鏈:1.在一RNase-free的0.2mlPCR管中,加入xul mRNA(大約500ng)1ul XhoIPrimer(1.4ug/ul)(5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTT
cDNA文庫組標準流程3
二.mRNA的分離 1.Oligotex mRNA Kits (QIAGEN）法 準備工作： 1.將Oligotex Suspension 置于37℃水浴中，旋轉混勻，溶解 Oligotex.,然后置于室溫。 2.將OBB Buffer置于37℃水浴中，旋轉混勻，重溶沉淀物，然后置于室溫。 3.將
cDNA文庫組標準流程2
(二)動物組織totalRNA的提取 1．根據表1選擇適當的組織量和相應的變性裂解液量，將變性裂解液分裝到RNase-free的50ml無菌離心管中，冰浴5分鐘。 2．將組織樣品放入變性裂解液中，在高速下勻漿15-30秒/次，直到看不見組織和細胞碎片。 3．根據表1加入適量2M的乙酸鈉（pH4.0）
cDNA文庫組標準流程1
一.Total RNA的提取 (一) 試劑配制 準備工作： 1.研缽、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml /100ml容量瓶、藥匙、 試劑瓶等玻璃制品均用錫紙包裹口部，置于烤箱內,180℃，烤6小時。 2.50ml/1.5ml離心管、槍頭等塑料
差減cDNA文庫法3
[大量制備生產單鏈噬菌體DNA]1.新鮮過夜培養的宿主菌XLI-Blue，以1：20稀釋在LB培養液中，在37℃培養擴增2小時。2.加1ml含單鏈cDNA的上清液。3.再于37℃繼續培養2小時。4.然后將全部溶液轉到500~1000mlLB中，生長5~6小時。5.9500rpm離心60分鐘，除去細菌
差減cDNA文庫法2
[cDNA末端磷酸化]1.70℃滅活反應后，稍微離心一下，置室溫5分鐘。2.在反應混合物（10μl）中加入：1μl10×連接緩沖液2μl10mMATP1μl（10μ）DNA激酶 [限制性內切酶消化]以得到粘性末端 1.限制性內切酶消化DNA和載體。 2.在37℃保溫1~5小時，然后冷卻到
差減cDNA文庫法1
[第一條鏈cDNA合成] 1.合成第一條cDNA鏈時，所有試劑應按下列順序依次加入： 10×第一條鏈合成緩沖液5.0μl 10mMdNTPMix(1.4μg/μl)2.5μl(終濃度1.25mM) Linkerprimer(1.4μl，終濃度100μg/μl) DEP
cDNA文庫組標準流程5
4EcoRIadaptor加接:1.往雙鏈 cDNA沉淀中加入9ulEcoRI adaptor(400ng/ul),4℃至少放置30分鐘以充分溶解cDNA沉淀;2.溶解完成后,順序加入下列試劑:1.2ul 10×Ligase Buffer1ul 10mMrATP1ul T4DNA Ligase(4U
關于cDNA文庫的原理介紹
一、定義 （cDNA Library）某種生物基因組轉錄的全部mRNA經反轉錄產生的cDNA片段分別與克隆載體重組，并將其引入到相應的宿主細胞中（一般為E.coli.）繁殖和擴增，理論上此群體就包含有該物種的全部mRNA信息，稱該生物基因組的cDNA文庫。 二、原理 經典cDNA文庫構建的
cDNA文庫組標準流程7
2．檢測：（PCR方法）取適量PCR薄壁管，置于冰上，按以下體系依次加入：各試劑均加好后，離心機上甩一下，使之沉底，置于PCR儀上待 PCR反應進入4℃后，取下PCR薄壁管，取7ulPCR產物加入3ul溴芬蘭跑電泳，同時上1Kb DNA ladder半小時后照相，觀察膠圖：insert、vector
cDNA文庫組標準流程八:pBlueScript－cDNA庫擴增
1．試劑及配方：2 x LB （1升）：??????? 20g??? 氯化鈉??????? 20g??? 蛋白提取物??????? 10g??? 酵母提取物????? 加入蒸餾水至1升，用NaOH調pH值至7.0，高壓滅菌2 x LB－甘油（12.5%）（200ml）175ml? 2 x LB液體2
cDNA文庫組標準流程三:cDNA雙鏈合成
1. Superscipt II—RT合成第一鏈:1. 在一RNase-free的0.2ml PCR管中,加入???????? xul?? mRNA(大約500ng)???????? 1ul?? Xho I Primer(1.4ug/ul)?????????? (5’ GAGAGAGAGAGAGAG
cDNA文庫的構建和篩選—在外界環境壓力條件下，...（二）
8 標記探針的合成9 Northern 印跡（1）10X MOPS 緩沖液： 200 mmol/L MOPS， 50 mmol/L 乙酸納， 10 mmol/L EDT A , pH 7. 0。（2）I. 25% 甲醛變性膠：將 3.75 g 瓊脂糖溶于 217 m L 雙蒸水中，加 E B 至
cDNA文庫的構建和篩選—在外界環境壓力條件下，...（一）
cDNA文庫的構建和篩選—在外界環境壓力條件下，新表達基因的鑒定方法實驗實驗步驟 一、材料所有化學試劑均為分子生物學級純度。所用塑料和玻璃制品，包括瓶子和移液器吸頭均經高壓蒸氣滅菌。涉及核酸的操作均需帶手套。1.總 RNA提取（1）無 RNase 水。加 I mL 焦 炭 酸 二 乙 酯（DEP
cDNA文庫分離基因的相關介紹
如果手中有足夠量可產生抗體的來源于真核細胞的蛋白質，可以通過雙抗體免疫法分離出此蛋白的基因。 基本原理： 核糖體沿mRNA進行多肽鏈合成時形成多聚核糖核蛋白體，而具有不同長度的新生肽鏈在核糖體上不斷延伸。 將從細胞勻漿液中制備出的多聚核糖核蛋白體同特定抗體一起保溫，形成多聚核糖體同抗體的復
差減－cDNA－文庫的建立實驗
實驗方法原理 實驗材料 ［＋］ 和 ［-］cDNA 文庫（ATCC 或 Stratagene）試劑、試劑盒 TE 緩沖液EcoRI EDTA蔗糖溶液瓊脂糖凝膠TBE 緩沖液乙醇S1 核酸酶S1 核酸酶緩沖液苯酚 氯仿 異丙醇乙酸鈉AluIRsaI去離子甲醜胺SDS酵母 tRNA氯仿 異丙醇磷
差減－cDNA－文庫的建立實驗
基本方案 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 實驗材料 ［＋］ 和 ［-］cDNA 文庫（ATCC 或 Stra
差減－cDNA－文庫的建立實驗
差減文庫包含了存在于一種細胞或組織而不存在于另一種細胞或組織的 mRNA cDNA 克隆。這個 cDNA 文庫被用來分離相應于一類 mRNA 的一組 cDNA 克隆，或用 于分離一個特定mRNA 的 cDNA 克隆。這中間篩選 cDNA 克隆的過程是很費勞力的。來源：《精編分子生物學實驗指南（第五版
YAC實驗——YAC文庫構建
YAC帶有天然染色體所有的功能元件，包括一個著絲粒，一個DNA復制起點，兩個端粒。YAC能夠容納長達幾百kb的外源DNA，這是質粒和黏粒辦不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色體步移中每次允許更大的步移距離，同時能夠減少完整基因組文庫所需的克隆數目。實驗步驟1. ?盡管當插入片段大于10
BAC/PAC－文庫的構建
BAC (Bacterial Artificial Chromosome，細菌人工染色體)文庫可用于：（1）全基因組測序；（2）構建物理圖譜、染色體步查；（3）基因篩選；（4）基因圖位克隆。實驗方法原理BAC是一種裝載DNA大片段的克隆載體系統，用于人、動物和植物基因組文庫構建。BAC具有插入片段較
BAC/PAC－文庫的構建
BAC文庫的構建 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 BAC是一種裝載DNA大片段的克隆載體系統，用于人、動物和植物基因組文庫構建。BAC具有插入片段較大(幾千個堿基至350kb)
cDNA文庫注意獲得起始RNA的介紹
構建cDNA文庫要求的RNA量比做RACE和Northern blot的要多，在材料允許的情況下一般的試劑盒均推薦采用純化總mRNA后進行反轉錄，這比直接采用總RNA進行反轉錄而構建的cDNA文庫好，雖然后者也并不是不能做。老版本CLONTECH的SMART 4的中級柱子要求純化后的總mRNA量
關于cDNA文庫的篩選鑒定的介紹
1．核酸雜交 是最常用，最可靠的方法之一，可大規模地分析文庫的克隆子。 1．同源探針：至少含有所需cDNA克隆的一部分確切序列，常用于以一個部分克隆分離cDNA文庫中的全長克隆。 2．部分同源探針：探針的序列與所要篩選的cDNA克隆的序列相關但不相同，常用于克隆家族基因。 3．總cDNA
DNA文庫的構建及其篩選
實驗材料?DNA試劑、試劑盒?升汞MS培養基瓊脂糖EcoR IHind IIIBamH IBg lII Pst I儀器、耗材?電泳儀尼龍膜實驗步驟 1.水稻 DNA 的提取水稻 DNA 的提取參照 Dellaporta, Wood 和 Hicks (1983) 法分離總基因組DNA并略有修改。 通過
DNA文庫的構建及其篩選
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 高等植物基因組的一個顯著特征是其內含有大量的 DNA 重復序列, 重復序列常位于異染色質區, 因此可能與染色體的結構有關 . 季靜等根據國際上 對基因組、染色體、結構蛋白的研究前沿, 提出染色體 DNA 平均每隔 30 kb