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試劑、試劑盒 TE 或去離子水PCR 產物儀器、耗材 離心機和轉子PCR 濾 件微量離心管實驗步驟 一、材料1. 緩沖液和溶液TE(lOmmol/L Tris-HCl，lmmol/L EDTA，pH7.5) 或去離子水2. 核酸和寡核苷酸待測序的 PCR 產物3. 離心機和轉子帶有固定傾角轉子的小型離心機，如 Eppemlorf5415C4. 特殊設備AmiconMicrocon-PCR 濾件（Millipore) 或者相當的產品，微董離心管或接收管二、方法1. 對每一個待純化的 PCR 產物，都在接收管中放置一個濾件，濾件的儲液面向上儲液池中加入 400ul 去離子水或 TE，注意加樣時不要觸及膜。加入 100ulPCR 產物，避免帶進礦物油。如果 PCR 產物不足 100ul, 用去離子水或 TE 補足，蓋上蓋子。2. 將 1 中所得組合體用帶有固定傾角轉子的離心機，l000 g 離心 15 min(例如，Eppendorf......閱讀全文
一滴殘留在裙子上的精液使得美國總統Bill Clinton不得不坦承他與白宮實習生有不正當的關系。因為他知道現在的生物科技就連一個精子也能被用來做為證據。這種將極微量的生物標本化為可供鑒定的現代技術正是PCR(Polymerase chain reaction)--聚合
利用各種PCR技術擴增特異DNA是獲得目的基因和特異探針的一種最有效、最簡便的方法。但PCR擴增出的片斷如不經進一步克窿是無法變成可利用基因，因此PCR擴增產物的克窿技術是DNA重組技術中的一個最重要部分，該技術是目前分子生物學實驗中最重點內容，要綜合前面實驗中所介紹的各種技術，起著承上啟下的作用。
PCR反應體系與反應條件 標準的PCR反應體系： 10×擴增緩沖液 10ul 4種dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10～100pmol 模板DNA 0.1～2ug Taq
PCR反應體系與反應條件 標準的PCR反應體系： 10×擴增緩沖液 10ul 4種dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10～100pmol 模板DNA 0.1～2ug
第八章聚合酶鏈式反應(PCR)擴增和擴增產物克隆第一節概述 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應)是一種選擇性體外擴增DNA 或RNA 的方法.它包括三個基本步驟: (1) 變性(Denature):目的雙鏈DNA 片段在94℃下解鏈; (2) 退火
試劑、試劑盒 緩沖液、溶液和試劑 酶和酶緩沖液 核酸和寡核苷酸 儀器、耗
試劑、試劑盒 緩沖液、溶液和試劑酶和酶緩沖液核酸和寡核苷酸儀器、耗材 專用設備實驗步驟 第 1 階段：DNA 引物的激酶處理研究表明很多種 DNA 聚合酶（比如，T7、修飾過的 T7、Taq、Vent、Tth 和 Klenow)具有脫氧核苷酸末端轉移酶（Tdt) 活性（Clark1988;H
PCR反應體系與反應條件 標準的PCR反應體系： 10×擴增緩沖液 10ul 4種dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10～1
PCR反應體系與反應條件 標準的PCR反應體系： 10×擴增緩沖液 10ul 4種dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10～100pmol 模板
PCR反應五要素：參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物： 引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。設計引
試劑、試劑盒緩沖液、溶液和試劑酶和酶緩沖液核酸和寡核苷酸儀器、耗材專用設備實驗步驟第 1 階段：DNA 引物的激酶處理研究表明很多種 DNA 聚合酶（比如，T7、修飾過的 T7、Taq、Vent、Tth 和 Klenow)具有脫氧核苷酸末端轉移酶（Tdt) 活性（Clark1988;Hu1993)。
第八章 聚合酶鏈式反應(PCR)擴增和擴增產物克隆第一節 概 述 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應)是一種選擇性體外擴增DNA或RNA的方法.它包括三個基本步驟: (1) 變性(Denature):目的雙鏈DNA片段在94℃下解鏈; (2) 退火(Annea
PCR擴增產物的克隆可以：（1）獲得目的DNA片段；（2）用于原核表達的研究；（3）廣泛應用于分子生物學相關研究。實驗方法原理平頭連接是將制備好的平頭載體和補平或削平的PCR產物直接進行連接。載體可用EcoR V或Sma I切成平頭；PCR產物純化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用
實驗室PCR 產物的電泳及純化一、目的(1)了解PCR產物電泳與純化的原理。(2)熟悉和掌握PCR產物電泳與純化的操作。二、原理在PCR過程中，部分引物和dNTPs在Taq酶等因子的作用下以DNA模板為指導合成新的DNA分子，當然還有一部分的引物和dNTPs沒有完成所期望的任務,以小分子的形式存在于
實驗方法原理 平頭連接是將制備好的平頭載體和補平或削平的PCR產物直接進行連接。載體可用EcoR V或Sma I切成平頭；PCR產物純化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用該酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。如果要求不高，PCR產物也可不加處理。如果使用Str
平端連接法 TA克隆法 實驗方法原理 平頭連接是將制備好的平頭載體和補平或削平的PCR產
PCR反應的zui大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產生。一、污染原因1、標本間交叉污染:標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染;標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍
實驗方法原理TA克隆 系統由Invitrogen公司（San Diego，CA）發展而來的商業性試劑盒，它用于PCR 產物的克隆 和測序。其原理是利用Taq酶能夠在PCR 產物的3'末端加上一個非模板依賴的A，而T載體是一種帶有3'T突出端的載體，在連接酶作用下，可以快速地、一步到位
PCR反應的zui大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產生。污染原因一、標本間交叉污染：標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染；標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染
T－載體的構建一：儀器：同質粒DNA提取實驗、酶切實驗及RT－PCR實驗二：試劑：SmaI、其余同質粒DNA提取實驗、酶切實驗及RT－PCR實驗三：操作：1：提純載體DNA2：將1ug提純的PGEMDNA用SmaI1ul進行全酶切（為了切割徹底、甚至能破壞酶切位點周圍堿基序列而防止自連發生，酶可過量
PCR技術代替了為測序而反復進行的分子克隆和模板制備步驟。PCR技術與自動測 序技術相結合后，它將成為一種最快、最有效的測定核苷權序列的方法。本章主要綜 述各種測模板的制備以及如何完成PCR產物的直接測序。與傳統的將PCR片段克隆入質 粒或病毒基因組相比，直接序列分析有兩個主要的優點:1)由于它是一
PCR反應的最大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產生. 一、污染原因 1、標本間交叉污染:標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染;標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣
PCR需要注意的一些問題擴增長目的片段當擴增大于5kb的目的片段時，可以使用用于超長PCR的酶或酶混合物以獲得zui佳產量）。Taq DNA聚合酶并不能有效擴增較長目的片段（大于5kb），可能是因為其缺少3'-5'外切核酸酶活性，不能糾正dNTP錯誤摻入。錯誤配對的延伸幾
概 述 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應)是一種選擇性體外擴增DNA或RNA的方法.它包括三個基本步驟: (1) 變性(Denature):目的雙鏈DNA片段在94℃下解鏈; (2) 退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當溫度(50℃左右)
常見問題PCR產物的電泳檢測時間一般為48h以內，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規則甚至消失。假陰性，不出現擴增條帶。PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及， ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中
實驗步驟 ##一、 從組織和培養細胞中分離RNA1.TRIzol試 劑（Invitrogen)。該試劑含有苯酚和硫氰酸鹽化合物，操作時應穿實驗服，戴手套，存放于 4°C 。2.氯仿。3.異丙醇。4.乙醇。5.焦炭酸二乙酯（DEPC) 處理的水
TA克隆常見問題分析及其解決方案 問 題 可能的原因 建 議 轉化后無 克隆菌產生 轉化過程有問題或感受態細胞失活 可通過轉化pUC18/19等未切割的可用于抗性篩選的質粒，檢測感受態細胞的轉化效率和轉化操作是否正確 插入對照DNA片段的陽性率低 1
擴增長目的片段當擴增大于5kb的目的片段時，可以使用用于超長PCR的酶或酶混合物以獲得最佳產量（圖24）。Taq DNA聚合酶并不能有效擴增較長目的片段（大于5kb），可能是因為其缺少3'-5'外切核酸酶活性，不能糾正dNTP錯誤摻入。錯誤配對的延伸幾率大大降低，減少了較長產物的產量
差異顯示聚合酶鏈反應（PCR) 可促進在諸多物種中與污染暴露相關的新分子標志物的鑒定。至今，已有多種差異顯示方法被詳細描述。這里，我們描述了一種改良的RNA 隨機引物觸發的 PCR 方 法（RNAarbitrarily primed PCR， RAP-PCR) , 主要涉及通過 羅 丹 明（rhod
實驗概要SLIC（Sequence and Ligation Independent Cloning）是一種不依賴于基因序列和連接反應的高效基因克隆新方法，它可以實現體外同源重組反應中多個DNA片段在單一反應中的裝配和單鏈的退火。實驗步驟1. 用限制性內切酶處理2微克載體，使用QIAEX II凝膠提