Northern雜交操作步驟和DNA探針的制備與標記（2）
(4) 將1 ~ 2 μl RNA 上樣緩沖液加到乙二醛化的RNA 樣品中，然后馬上把RNA樣品加到凝膠加樣孔中，留著兩邊最外面的兩個孔不要加樣。將RNA 相對分子質量標準參照物加到最外面的孔中。(5) 以5V/cm 的電壓進行電泳，直到溴酚藍遷移大約8 cm。(6) 將凝膠放在保鮮膜上，在紫外燈下觀察RNA。把透明尺和凝膠對齊，在紫外燈下拍照。(7) 在照片上量出從加樣孔到各RNA 條帶的距離。以RNA 片斷大小的對數（log10）值對遷移的距離作用。用得到的曲線計算點雜交檢測到的RNA 的大小。(8) 利用半干轉印系統把RNA 固定在固體支持物上。變性RNA的轉移和固定：(1) 將凝膠轉移至培養皿中，用鋒利的刀片修去凝膠的無用部分，在凝膠的左上角切取一角作為標記。(2) 將凝膠置于0.5×TBE中平衡30min。(3) 用切紙刀裁一張長寬均大于膠1mm 的尼龍膜，切去膜一角，使其與凝膠的切角對應。(4) 將尼龍膜和6 張與膠......閱讀全文
Northern雜交試驗指導手冊(5)
?E.雜交建議雜交條件：探針濃度50~100ng/ml，溫度68℃過夜。1.將印跡膜置于裝有預雜交液的雜交袋中（每100cm2膜20ml預雜交液），封好雜交袋，在設定的雜交溫度下預雜交至少1小時。2.將探針在沸水浴中變性10min.(探針一經變性，立即使用)，用預雜交液稀釋成設定濃度。3.將雜交袋中
Northern的雜交有哪些過程
Northern雜交的總體過程與Southern雜交相似，只不過在印跡（Blotting）過程中轉移的是RNA而不是DNA，這種將RNA樣品從凝膠轉移濾膜的方法，其設計者為之起了一個與Southern：blotting對應的名稱Northern：blotting。其分子雜交過程與Southern分子
Northern雜交試驗指導手冊(4)
8.將樣品測試條和對照測試條按下列順序在上述準備的溶液中浸漬處理，兩步驟直接讓多余的溶液滴在吸水紙上。①. 封閉， 2min.→②. 抗體結合， 3min.→①. 封閉， 1min.→③. 洗膜, 1min. →④. 平衡， 1min. →⑤. 顯色反應（黑暗），5－30min.9.顯色反應30mi
Northern雜交試驗指導手冊（7）－雜交結果檢測
方法一、化學發光檢測試劑及其配制：洗膜緩沖液：100mmol Maleic acid150mmol NaCl0.3%(v/v) Tween20pH 7.5Maleic acid緩沖液：100mmol Maleic acid150mmol NaClpH 7.5封閉液：5% (w/v) SDS17mmo
總RNA提取與Northern雜交（2）
4、Loading buffer（10ul每個樣） ? 總體積 100ul 200 ul 500ul 10×MOPS
Northern印跡和總RNA雜交實驗
試劑、試劑盒 甲醛凝膠溶液RNA 電泳緩沖液儀器、耗材 凝膠模梳齒凝膠用具實驗步驟 1. 用肥皂和水徹底清洗凝膠模，梳齒和凝膠用具。2. 準備甲醛凝膠溶液。甲醛凝膠溶液（300 ml 1％ 瓊脂糖凝膠）：瓊脂糖，3.0 g10x RNA 電泳緩沖液，30 ml ? ??Milli-Q 或用玻璃器皿蒸
Northern印跡和總RNA雜交實驗
Northern印跡分析雜交和放射自顯影試劑、試劑盒甲醛凝膠溶液 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?RNA 電泳緩沖液 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
總RNA提取與Northern雜交（3）
第二天：將上述物品揭開，將膠正面朝下，膜正面朝上，用鉛筆作好標記。將膠浸泡在EB中1-2分鐘，用DEPC H2O清洗，將膜放在濾紙上面，夾好，4度下保存，或者直接進行預雜交。UV雜交（有助于RNA結合到膜上面）。五、預雜交和雜交預雜交和雜交 buffer： 100ul20×SSC 25ml （5×S
Northern印跡和總RNA雜交實驗
Northern印跡分析 雜交和放射自顯影 ? ? ? ? ? ? 試劑、試劑盒 甲醛凝膠溶液 RNA 電泳緩沖液
總RNA提取與Northern雜交（1）
一、 總RNA的提取1、 取組織10-50毫克，剪切成大小在0.5厘米以內的碎片，加入×5的RNA later（約2毫升）。樣品在37度可保存1天。室溫下1周，4度下1個月。2、 勻漿：用Rnase Erase spray（ICN）清理勻漿器頭部（7mm），用DEPC水和乙醇清洗，將上述樣品用鑷
Northern雜交技術的方法和步驟
Northern雜交與Southern雜交很相似。主要區別是被檢測對象為RNA,其電泳在變性條件下進行,以去除RNA中的二級結構,保證RNA完全按分子大小分離。變性電泳主要有3種:乙二醛變性電泳、甲醛變性電泳和羥甲基汞變性電泳。電泳后的瓊脂糖凝膠用與Southern轉移相同的方法將RNA轉移到硝酸纖
Northern雜交試驗指導手冊（1）－RNA提取
方法一、改良異硫氰酸胍提取法試劑及其配制異硫氰酸胍變性液：貯存液－在含484ml 水（經DEPC處理）, 17.6ml 0.75mol/L檸檬酸鈉（pH7.0）和26.4ml10%Sarkosyl的溶液中加入250g異硫氰酸胍，加熱至60~65℃并持續攪拌使之充分溶解。貯存液室溫保存備用（不超過3個
northern,southern,western雜交的具體步驟
所用于分析的對象不同。 Northern雜交用于分析RNA； Southern雜交用于分析DNA； Western雜交用于分析蛋白質。大致過程如下： (1) 酶切DNA, 凝膠電泳分離各酶
Northern印跡和總RNA雜交實驗——雜交和放射自顯影
實驗材料mRNA試劑、試劑盒甲酰胺SSPEDenhardt 試劑SDS儀器、耗材濾膜實驗步驟1. 濾膜進行 1~2 小時預雜交。在 42℃：50% 甲酰胺5x SSPE2 x Denhardt 試劑0.1% SDS或者在 68℃：6x SSC2x Denhardt 試劑0.1% SDS2. 把已變性
Northern雜交試驗指導手冊（2）－RNA質量檢測
二、RNA質量檢測提取的RNA需要對其質量和數量進行檢測。實驗室常用的方法有紫外吸收值檢測和電泳檢測兩種。方法一、紫外吸收檢測試劑：TE ( 10mmol/L Tris, 1mmol/LEDTA)。dH2O試驗程序1．預熱紫外分光光度計10～20min.。2．取兩個1ml的狹縫石英杯，一個裝入1ml
Northern雜交試驗指導手冊（5）－RNA探針制備
五、RNA探針制備（根據the DIG system user's guide）A． 地高辛標記的體外轉錄試劑及其配制（試劑盒提供）：10× NTP標記混合物：in Tris-HCl (pH 7.5)10mmol ATP10mmol CTP10mmol GTP6.5mmol UTP3.5mm
核酸雜交技術(Northern－Blot、Southern－Blot和探針標記）
（一）Southern Blot原理：將待檢測的DNA分子用/不用限制性內切酶消化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標記物標記的DNA或RNA探針進行反應。如果待檢物中含有與探針互補的序列，則二者通過堿基互補的原理進
Northern雜交試驗指導手冊（4）－模板DNA的制備
A．質粒DNA的小量提取試劑及其配制含AP的LB液體培養基TE緩沖液：10mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)1mmol/L EDTA (pH 8.0)溶液I： 25mmol/L Tris-Cl (pH 8.0)10mmol/L EDTA50mmol/L 葡萄糖高壓滅菌15min.后，4
核酸蛋白轉移電泳及雜交（Southern－Blot、Northern－Blot和...1
一、DNA Southern Blot及雜交 本技術可用于基因組DNA特定序列定位，尤其可分析某些基因的限制性內切酶長度多態性，對遺傳性疾病的早期基因診斷、產前診斷或基因變異等方面的研究有應用價值，其過程包括：樣品DNA內切酶水解、水解片斷的瓊脂糖凝膠電泳分離、分離后水解片斷的轉移(固定)、特異
Northern雜交法對mRNA的檢測、分析及定量的方法
方法：Northern雜交目標RNA的類型：mRNA同時定量的目標RNA的數量：通常為一個，最多幾個。用途：主要用于估測不同組織、細胞中目標mRNA的分子質量，可用于mRNA的粗略定量。缺點：需要大量RNA；只可同時檢測一個或最多幾個mRNA；與PCR方法相比，靈敏度差、耗時。? ?? ?
核酸蛋白轉移電泳及雜交（Southern－Blot、Northern－Blot和...2
(10)倒去預雜交液，加入含探針的雜交液封口，42℃ 6h或過夜。 (11)取出轉移膜，按以下條件洗膜 1×SSC，0.1%SDS室溫2×15分鐘 0.25SSC，0.1%SDS,42℃ 2×15分鐘，氣中干燥。 (12)將雜交后的膜曝光于X光片，暗盒中放射自顯影2～
Northern雜交操作步驟和DNA探針的制備與標記（2）
(4) 將1 ~ 2 μl RNA 上樣緩沖液加到乙二醛化的RNA 樣品中，然后馬上把RNA樣品加到凝膠加樣孔中，留著兩邊最外面的兩個孔不要加樣。將RNA 相對分子質量標準參照物加到最外面的孔中。(5) 以5V/cm 的電壓進行電泳，直到溴酚藍遷移大約8 cm。(6) 將凝膠放在保鮮膜上，在紫外燈下
Northern雜交操作步驟和DNA探針的制備與標記（1）
一．原理Northern 雜交是用來測量真核生物RNA的量和大小估計其豐度的實驗方法，可以從大量的RNA樣本同時獲得這些信息。其基本步驟包括：1. 完整mRNA的分離2. 根據RNA的大小通過瓊脂糖凝膠電泳對RNA進行分離3. 將RNA 轉移到固相支持物上，在轉移的過程中，要保持RNA 在凝膠中的相
Northern
繼分析DNA的Southern雜交方法出現后，1977年Alwine等人提出一種與此相類似的、用于分析細胞總RNA或含poly A尾的RNA樣品中特定mRNA分子大小和豐度的分子雜交技術，這就是與Southern相對應而定名的Northern雜交技術。這一技術自出現以來，已得到廣泛應用，成為分析mR
分子生物學里的Northern－Southern雜交的原理
①Southern印跡雜交：用于分析DNA,包括兩個主要過程：一是印跡,即將待測定核酸分子通過一定的方法轉移并結合到一定的固相支持物（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上；二是退火,與固定于膜上的同位素標記的探針進行分子雜交,并進行顯影觀察,這樣即可查找所需DNA的位點.②Northern印跡雜交：將RNA從瓊
Northern印跡的制備和Northern印跡
Northern印跡的制備 預備： 1.按下述步驟，每泳道加10～20μg總RNA或 0.5～1μgpoly(A)+RNA進行甲醛/ 瓊脂糖凝膠電泳，將凝膠放在紫外線透照儀上，旁邊置一標尺進行拍照。 a. 總RNA（10～20μg）用下列溶液在65℃溫育5min：
Northern－Blot
試劑、試劑盒 20XMOPS 緩沖液 20XSSC 50XDenhardt 液 雜交液 10%SDS儀器、耗材 水平電泳裝置 水浴 硝酸纖維素膜或尼龍膜 3 MM 濾紙 紫外交聯儀 雜交管 雜交爐 [32P] 標記的 DNA 或 RNA 探針實驗步驟 一、材料與設備1) 水平電泳裝置2) 水浴3)
Northern－Blot
Northern Blot Northern Blot ? ? ? ? ? ? 試劑、試劑盒 20XMOPS 緩沖液 20
Northern－blot技術
經乙二醛和二甲基亞砜變性處理后進行的RNA電泳 這一方法原于McMaster和Carmichael(1977)。 含有乙二醛－DMSO的凝膠比含有甲醛的凝膠更難于進行電泳， 因為前者泳動速率較慢而且需將電泳液時行循環以避免電泳過程中形成過高的H＋梯度。盡管上述兩種凝膠具有近乎相等的分辨率（Mill
Protocol－of－Northern－blot
Protocol of Northern blot質粒的轉化和擴增質粒的鑒定目的基因片段的切割3.1樣品雙酶切(175μl水解體系)DW 115μlBuffer B(10×) 17.5μlBaM H 15μlPst I 17μlDNA(MMP-9) 16μlBSA 4.5μl37℃水浴，3h。3.2