DNA測序技術（非同位素銀染測序系統操作技術與T7DNA...2
（1）過夜培養的宿主細胞(如NM522或JM101)用3ml TYP肉汁培養基以1:100稀釋。在37℃強烈震蕩1小時之后，細胞進入對數早期。此時，將一個合適的含有重組M13的噬菌斑(連同瓊脂)用滴管轉入該細胞培養液中。（2）37℃強烈震蕩(300rpm) 培養6小時。（3）把細胞培養液轉入兩只1.5ml eppendorf管，12000g離心15分鐘。上清液轉移到新的eppendorf管再離心15分鐘。小心地取出1-1.2ml上清液(注意不能觸及沉淀)，再轉到新的eppendorf管。 .（4）將0.25體積的含20%PEG(-8000)的3.75M醋酸銨(pH7.5)加入上清液以沉淀噬菌體。混勻后置冰上30分鐘，再以 12000g離心15分鐘，傾去上清液，再以同樣方法離心一次，用吸液器尖頭將殘留的PEG充分吸干凈。此時應能見管底有芝麻大小的噬菌體顆粒沉淀。（5）將沉淀物重溶于400ml TE緩沖液中。（6）加等體積氯仿/......閱讀全文
DNA測序技術（非同位素銀染測序系統操作技術與T7－DNA...2
（1）過夜培養的宿主細胞(如NM522或JM101)用3ml TYP肉汁培養基以1:100稀釋。在37℃強烈震蕩1小時之后，細胞進入對數早期。此時，將一個合適的含有重組M13的噬菌斑(連同瓊脂)用滴管轉入該細胞培養液中。（2）37℃強烈震蕩(300rpm) 培養6小時。（3）把細胞培養液轉入兩只1.
DNA測序技術（非同位素銀染測序系統操作技術與T7－DNA聚...
3、質粒膜板制備：參照第一章所述的方法。（二）超螺旋質粒DNA 的堿變性：1、取4mg（約2pmol）超螺旋質粒DNA 至一eppendorf管中，加無離子水到終體積18ml。2、加2ml 2mmol/L NaOH/2mmol/L EDTA 溶液，置于室溫(25℃下）保溫5分鐘。3、加2ml 2mo
DNA測序技術（非同位素銀染測序系統操作技術與T7－DNA...5
（三）電泳：1、預電泳（1）當凝膠聚合完全后，撥出鯊魚齒梳，將該梳子反過來，把有齒的一頭插入凝膠中，形成加樣孔。（2）立即將膠板固定在測序凝膠槽中，一般測序凝膠槽的上下槽是分開的，因而只有在固定好凝膠板后，方能加入TBE緩沖液。（3）稀釋10×TBE緩沖液至1×TBE，將該緩沖液加入上下二個電泳槽中
DNA測序技術（非同位素銀染測序系統操作技術與T7－DNA...3
二、材料待測的DNA 模板，可用雙鏈或單鏈模板。 三、設備高壓電泳儀，測序用電泳槽，照相顯影用大號塑料盆，制膠設備，吹風機，放射自顯影盒，X-光片。 四、試劑 1、5×T7 DNA 聚合酶緩沖液：200mmol/L Tris?Cl，pH7.5，100mmol/L MgCl2，
DNA測序技術（非同位素銀染測序系統操作技術與T7－DNA...6
3、為阻止Taq DNA 聚合酶延伸非特異性退火引物， 熱循環儀必須預熱至95℃。溫度變換應越快越好。下面的循環時間不包括變溫時間。如果你無法確定使用何種模式，建議從模式1開始。 ? 模式1：適用于引物
DNA測序技術（非同位素銀染測序系統操作技術與T7－DNA...4
7. 在超純水中浸洗凝膠兩次，每次2分鐘，注意在本操作中戴手套拿著膠板邊緣避免在膠上印上指紋。8. 將凝膠置于室溫干燥或用抽氣加熱法干燥。在可見光燈箱或亮白，黃色背景(如紙)上觀察凝膠，若需永久保存的記錄，則可用EDF膠片保留實驗結果。[注意] 測序產物的銀染是顯現序列信息的一種新方法，本系統的成敗
DNA測序技術（非同位素銀染測序系統操作技術與T7－DNA...7
在分子生物學研究中，DNA 的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎。目前用于測序的技術主要有Sanger等（1977）發明的雙脫氧鏈末端終止法和Maxam和 Gilbert（1977）發明的化學降解法。這二種方法在原理上差異很大，但都是根據核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的堿基
非同位素銀染測序系統操作技術
Promega公司的SILVER SEQUENCETM DNA測序系統是一種無放射性的序列分析系統，它通過靈敏的銀染方法檢測凝膠中的條帶。銀染提供了一種對于放射性或熒光法來說更加快速，廉價的替代方法。測序結果可以在同一天內得到；電泳完成后經90分鐘就可讀序，這是常規的放射性測序法做不到的。 此外
影響DNA測序技術測序產物銀染的因素
1. 水的質量對于染色的成功極其重要。超純水(NANOpureR 或Milli-QR 的水)或雙蒸水可獲得較好的效果, 如果水中有雜質, 則低分子量條帶可能無法出現。 2. 碳酸鈉也非常重要。使用新鮮的，美國化學學會級碳酸鈉較好，如Fisher和Kodak ACS試劑級碳酸鈉(Fisher C
DNA測序——非同位素銀染
實驗方法原理Promega公司的SILVER SEQUENCETM DNA測序系統是一種無放射性的序列分析系統，它通過靈敏的銀染方法檢測凝膠中的條帶。 銀染提供了一種對于放射性或熒光法來說更加快速，廉價的替代方法。測序結果可以在同一天內得到；電泳完成后經90分鐘就可讀序，這是常規的放射性測序法做不到
關于DNA測序技術的測序凝膠的銀染介紹
染色過程要求凝膠浸在塑料盤中。因而至少使用兩個盤子，大小與玻璃板類似。在盤中加入新鮮溶液之前須用高質量的水洗滌盤子。 1.電泳完畢后用一個塑料片子小心地分開兩板，凝膠應該牢固地附著在短玻璃板上。 2. 固定凝膠：將凝膠(連玻璃板)放入塑料盤，用固定/停止溶液浸沒,充分振蕩20分鐘或直至樣品中
關于DNA測序測序凝膠的銀染
染色過程要求凝膠浸在塑料盤中。因而至少使用兩個盤子，大小與玻璃板類似。在盤中加入新鮮溶液之前須用高質量的水洗滌盤子。 1. 電泳完畢后用一個塑料片子小心地分開兩板，凝膠應該牢固地附著在短玻璃板上。 2. 固定凝膠：將凝膠（連玻璃板）放入塑料盤，用固定/停止溶液浸沒，充分振蕩20分鐘或直至樣品
DNA測序測序凝膠的銀染的影響因素
測序產物的銀染是顯現序列信息的一種新方法，本系統的成敗受幾個因素的影響 ① 水的質量對于染色的成功極其重要。超純水（NANOpureR或Milli-QR的水）或雙蒸水可獲得較好的效果，如果水中有雜質，則低分子量條帶可能無法出現。 ② 碳酸鈉也非常重要。使用新鮮的，美國化學學會級碳酸鈉較好，如
DNA測序技術非同位素銀染色法介紹
DNA測序系統是一種無放射性的序列分析系統，它通過靈敏的銀染方法檢測凝膠中的條帶。 銀染提供了一種對于放射性或熒光法來說更加快速，廉價的替代方法。測序結果可以在同一天內得到；電泳完成后經90分鐘就可讀序，這是常規的放射性測序法做不到的。 此外，SILVER SEQUENCETM系統用未修飾的5
T7－DNA聚合酶測序技術
一、概述T7 DNA聚合酶最初具有5'→3'聚合酶活性以及單鏈和雙鏈3'→5'外切酶活性。當T7 DNA聚合酶用適當方法處理后，可使3'→5'外切酶活力明顯下降。改造后的T7 DNA聚合酶又稱T7測序酶。使用T7測序酶得到的測序數據具有在每個堿
DNA測序的測序技術
高通量測序技術（High-throughput sequencing）又稱“下一代”測序技術（Next-generation sequencing technology），以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短等為標志。根據發展歷史、影響力、測序原理和技術不同等，主要有以
DNA測序非同位素銀染色法的測序反應
1. 對于每組測序反應，標記四個0.5 ml eppendorf管（G、A、T、C）。每管加入2 ml適當的d/ddNTP混合物（d/ddNTP Mix）。各加入1滴（約20 μl）礦物油，蓋上蓋子保存于冰上或4℃備用。 2. 對于每組四個測序反應，在一個eppendorf管中混合以下試劑：
概述DNA測序技術的操作
成功地使用銀染測序系統需要對提供的操作方法進行仔細考慮。銀染不如放射性檢測法靈敏，而需要更多的模板量，此外，也不可能通過延長X-光膠片曝光時間的方法增加信號強度。因此，請使用推薦的DNA模板量, 每次均使用所提供的對照檢查系統的可靠性，并且注意如下幾點： （1） DNA的濃度和純度必須經過瓊脂
DNA測序技術
目前還有一種基于半導體芯片的新一代革命性測序技術——Ion Torrent。該技術使用了一種布滿小孔的高密度半導體芯片， 一個小孔就是一個測序反應池。當DNA聚合酶把核苷酸聚合到延伸中的DNA鏈上時，會釋放出一個氫離子，反應池中的PH發生改變，位于池下的離子感受器感受到H+離子信號，H+離子信號再直
DNA測序非同位素銀染色法
SILVER SEQUENCETM DNA測序系統是一種無放射性的序列分析系統，它通過靈敏的銀染方法檢測凝膠中的條帶。 銀染提供了一種對于放射性或熒光法來說更加快速，廉價的替代方法。測序結果可以在同一天內得到；電泳完成后經90分鐘就可讀序，這是常規的放射性測序法做不到的。 此外，SILVER S
DNA測序技術的測序規律
生成互相獨立的若干組帶放射性標記的寡核苷酸，每組寡核苷酸都有固定的起點，但卻隨機終止于特定的一種或者多種殘基上。由于DNA上的每一個堿基出現在可變終止端的機會均等，因此上述每一組產物都是一些寡核苷酸混合物，這些寡核苷酸的長度由某一種特定堿基在原DNA全片段上的位置所決定。在可以區分長度僅差一個核苷酸
DNA測序技術的測序原理
化學修飾法測序原理化學試劑處理末段DNA片段，造成堿基的特異性切割，產生一組具有各種不同長度的DNA鏈的反應混合物，經凝膠電泳分離。化學切割反應：包括堿基的修飾，修飾的堿基從其糖環上轉移出去在失去堿基的糖環處DNA斷裂。Sanger法測序的原理就是利用一種DNA聚合酶來延伸結合在待定序列模板上的引物
DNA測序方法非同位素銀染色法的操作步驟
一、試劑準備1. SILVER SEQUENCETM DNA測序試劑盒。2. 丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺儲備液（38%丙烯酰胺 W/V，2%甲叉雙丙烯酰胺 W/V）：95 g丙烯酰胺，5 g甲叉雙丙烯酰胺溶于140 ml 雙蒸水中，定容至250 ml，0.45 mm過濾器過濾后，貯于棕色瓶中，置于4℃
DNA測序技術綜述
1977年，Sanger團隊完成人類歷史上第一個基因組序列噬菌體X174測序，并在3年后，成為“兩度”獲得諾貝爾化學獎的人（前一次是1958年）。Sanger測序技術誕生，讓DNA片段的測序成為現實，此后這一技術獨領風騷20多年。再后來的20年里，二代測序走向成熟、三代測序嶄露頭角，DNA測序技術以
DNA測序技術的測序的規律
生成互相獨立的若干組帶放射性標記的寡核苷酸，每組寡核苷酸都有固定的起點，但卻隨機終止于特定的一種或者多種殘基上。由于DNA上的每一個堿基出現在可變終止端的機會均等，因此上述每一組產物都是一些寡核苷酸混合物，這些寡核苷酸的長度由某一種特定堿基在原DNA全片段上的位置所決定。在可以區分長度僅差一個核苷酸
DNA測序技術的研究與發展
70年代末，WalterGilbert發明化學法、FrederickSanger發明雙脫氧終止法手動測序，同位素標記80年代中期，出現自動測序儀（應用雙脫氧終止法原理）、熒光代替同位素，計算機圖象識別90年代中期，測序儀重大改進、集束化的毛細管電泳代替凝膠電泳2001年完成人類基因組框架圖
DNA測序技術的技術原理
化學修飾法測序原理化學試劑處理末段DNA片段，造成堿基的特異性切割，產生一組具有各種不同長度的DNA鏈的反應混合物，經凝膠電泳分離。化學切割反應：包括堿基的修飾，修飾的堿基從其糖環上轉移出去在失去堿基的糖環處DNA斷裂。Sanger法測序的原理就是利用一種DNA聚合酶來延伸結合在待定序列模板上的引物
DNA測序技術操作的注意事項
1、測序所用模板DNA的量一般按下面要求加入： 模板種類/長度 模板量 200bp (PCR產物) 16ng(120fmol) 3000-5000bp（超螺旋質粒DNA) 4mg (2pmol) 48000bp(λ,粘粒DNA) 1mg(31fmol) 由于超螺旋質粒產生的信號比松弛
DNA測序技術自動測序法介紹
自動測序法基因分析儀(即DNA測序儀)，采用毛細管電泳技術取代傳統的聚丙烯酰胺平板電泳，應用該公司ZL的四色熒光染料標記的ddNTP(標記終止物法)，因此通過單引物PCR測序反應，生成的PCR產物則是相差1個堿基的3'末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物，使得四種熒光染料的測序PCR產物
DNA測序技術的測序反應的介紹
1. 對于每組測序反應，標記四個0.5ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml適當的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(約20ml)礦物油，蓋上蓋子保存于冰上或4℃備用。 2. 對于每組四個測序反應,在一個eppendorf管中混合以下試劑： （1