PDL1的糖基化和三陰性乳腺癌的免疫治療

　　一、前言

　　幾十年來癌癥的治療一直受到了科學家的極大關注。乳腺癌的治療在過去20年內得到了極大程度的發展，雖然該疾病的死亡率大幅度降低，但該疾病的發病率仍然非常高。在各類乳腺癌中，“三陰性乳腺癌”因為缺少治療靶標（如雌激素受體、孕酮受體和人表皮生長因子受體2），一直是治療的難點。令科學家感興趣的是：“三陰性乳腺癌”腫瘤里具有最多的腫瘤浸潤性淋巴細胞，這些淋巴細胞被推測有助于抵抗腫瘤生長，然而三陰性乳腺癌會使腫瘤中的淋巴細胞沉默或失活。這也給我們一個提示，對于三陰性乳腺癌，如果我們使用免疫治療方法激活殺傷腫瘤的淋巴細胞活性，將會是一個新的治療策略。

　　二、什么是免疫抑制機制

　　該講座先介紹了最重要的一種免疫抑制機制，即“PD-L1和PD-1作用機制”。癌細胞在細胞表面表達PD-L1，PD-L1將會鏈接T細胞的PD1，這種關聯將最終關閉T細胞的活性，也就是發生“免疫逃逸”。科學家現在開發了單克隆抗體，可以專一性地識別癌細胞上的PD-L1或T細胞上的PD-1。這種策略將有助于掩蓋這兩種分子的相互作用的表面，因此可以阻斷PD-L1和PD-1的鏈接，從而重新激活T細胞的活性，允許T細胞識別癌細胞，然后清除這些它們。目前，這類治療的整體響應率在大概20%-40%。演講者判斷“三陰性乳腺癌”一定存在類似的免疫抑制機制。

　　圖1.PD-L1和PD-1作用機制

　　本講座通過研究三陰性乳腺癌細胞的PD-L1的糖基化和穩定性，探索了用單克隆抗體阻斷“免疫逃逸”的機制，及研發出新的“抗體和藥物結合物（ADC）”來治療三陰性乳腺癌。

　　三、實驗方法及結果

　　演講者先研究了癌細胞上的PD-L1，想弄明白PD-L1表達在癌細胞的哪個部位？因為PD-L1的分子量為33千道爾頓，而Western Blot實驗表明，33千道爾頓的蛋白質表達是非常少的，而50千道爾頓的蛋白質表達非常多。經過一系列的基因敲除實驗，證實這個高分子量的蛋白就是PD-L1信號，是高度糖基化的PD-L1。用突變方法發現PD-L1只在其細胞外區域的4個NXT結構域上發生了糖基化。

　　為了驗證糖基化的PD-L1和PD-1的相互作用，演講者使用IncuCyte活細胞動態成像系統對PD-L1和PD-1之間的動態變化進行定量。向有糖基化PD-L1的癌細胞（紅色核標記）溶液中加入綠色熒光標記的PD-1蛋白質，在處理后12個小時的時候，細胞表面有大量的綠色聚集，說明PD-L1和PD-1有相互作用。而對于非糖基化的PD-L1的穩定克隆，并沒有看到很多的綠色熒光，這意味著PD-L1和PD-1在12個小時之后沒有相互作用。結果顯示這個糖基化結構是蛋白相互作用所必須的。

　　圖2.用IncuCyte成像儀對PD-L1和PD-1之間的動態變化進行定量

　　為了理解糖基化的功能，演講者再次使用IncuCyte成像儀來模擬T細胞存在時癌細胞和T細胞的動態相互作用。在此例中，對于BT549核IP細胞，加入活化的T細胞，共同孵育5天時間，用表示Caspase 3活性的綠色熒光表示癌細胞的凋亡。只要癌細胞開始死亡，就可以看到紅色熒光的減弱和綠色熒光的增強。結果表明：糖基化PD-L1的癌細胞對T細胞殺傷具有抵抗作用，而非糖基化的癌細胞對T細胞殺傷非常敏感。

　　圖3.用IncuCyte成像儀來模擬T細胞存在時癌細胞和T細胞的動態相互作用

　　下一步，演講者想了解調控糖基化的上游信號是什么？他們將兩種三陰性乳腺癌細胞BT549和BT468，用不同的刺激物，如EGF，IGF，HGF，FGF和TGFβ處理。發現EGF可以一致地誘導兩種三陰性乳腺癌細胞的PD-L1的糖基化。糖基化的PD-L1很穩定，而非糖基化的PD-L1半衰期很短。上游信號EGF，可以增加PD-L1的糖基化形式。所以如果我們抑制EGFR信號，我們就可以使同源動物模型中的三陰性乳腺癌細胞對“抗-PD-1”的治療敏感。

　　另一個發現是：三陰性也會誘發慢性的炎癥。他們想了解為什么這些炎癥會引起癌癥的發展。演講者發現，在腫瘤微環境中，巨噬細胞具有分泌TNFα（腫瘤壞死因子α）的能力，而TNFα會識別癌細胞的TNFα受體。TNFα將活化NF-kappaB，并且引起p65的核轉移，然后開啟CSN5的表達。CSN5是一種泛素化酶，該酶將穩定PD-L1，誘導癌細胞的免疫抑制功能，促進癌細胞的發展。

　　演講者與藥廠合作，開發抗糖基化PD-L1的抗體。他們將糖基化的PD-L1作為抗原接種在小鼠上，創造了3,000個雜交瘤克隆。然后用流式細胞儀篩選這3,000個克隆，努力尋找能特異性識別糖基化PD-L1，而不識別非糖基化PD-L1的抗體。然后用IncuCyte成像儀進一步揭示哪個抗體具有阻斷PD-L1和PD-1相互作用的功能。他們使用了Essen BioScience的技術和pHrodo吞噬系統，來研究抗體是否能結合糖基化的PD-L1，然后誘導這個PD-L1的內部化，并進入溶酶體被細胞降解。演講者將STM108抗體用熒光染料標記上熒光。當細胞開始吞噬這些抗體時，IncuCyte成像儀中將會觀察到紅色熒光。在此例中，當他們將STM108抗體加入PT549的穩定克隆中時，可以看到在12個小時的過程中能誘導出很漂亮的紅色熒光，暗示STM108抗體可以特異性地內化到癌細胞中去。然后在處理5天之后做了Western Blot，可以發現大量的PD-L1減少了，暗示PD-L1發生了降解。

　　圖4.用IncuCyte成像儀觀察pHrodo吞噬系統，暗示STM108抗體可以特異性地內化到癌細胞中去。

　　演講者又研究了抗體和藥物結合技術，挑選MMAE作為彈頭，將細胞毒性的藥物結合到抗體上。當小鼠具有PD-L1表達，用“抗體藥物結合物（ADC）”處理之后，它們的腫瘤生長發生了顯著降低。當用糖基化ADC抗體處理之后，4T1-hPDL1腫瘤也不再生長。當小鼠用糖基化的MMAE抗體處理后，可觀察到腫瘤微環境中產生強烈的紅色熒光，表示Caspase 3的活性增加，細胞發生凋亡。一旦發生內吞事件，PD-L1蛋白將進入溶酶體并被降解，隨著抗體和PD-L1的降解，針對癌細胞的細胞毒性藥物就會被釋放，然后殺傷PD-L1高表達的癌細胞。這也會產生“旁觀者效應”，可清除不表達PD-L1的癌細胞。

　　圖5.觀察腫瘤微環境中的紅色熒光，表示Caspase 3的活性增加

　　四、結論

　　基于他們的信號分析，演講者可以設計策略，努力分離能特異性識別糖基化PD-L1的單克隆抗體。他們第一次發現這個抗PD-L1抗體可以交聯結合在膜上的“PD-L1”分子，并且誘導這個蛋白的內吞作用，因此可以讓抗體攜帶細胞毒性藥物，通過內吞釋放該藥物，殺死癌細胞，引發對三陰性乳腺癌的深遠的療效。