實驗概要
間接標記需要兩個孵育步驟，先與一抗再與合適的第二抗體孵育，二抗（不是一抗）結合了熒光染料（FITC、PE、Cy5 等）。請注意這是一個普遍的程序，您可以根據自己的使用情況進行調整。
實驗步驟
1. 收集并洗滌細胞，然后確定細胞總數。
細胞通常在聚苯乙烯的圓底 12 x 75 mm2 Falcon 管中染色。其實，細胞可以在任何適合離心機用的容器中染色，例如試管、EP 管、96 孔圓底酶標板。一般來說，細胞應該充分離心，以便去除上清時減少細胞損失；但也不能太劇烈，不然細胞會很難重懸。
離心后通常要檢查細胞活性，應該在 95% 左右，不能小于 90%。
2. 用冰冷 PBS（10% 胎牛血清和 1% 疊氮化鈉）將細胞重懸成約 1-5 × 106 個細胞/ml。
3. 每管中加入 100 μl 的細胞懸液。
4. 加入 0.1-10 μg/ml 的第一抗體，如有必要可用 3% BSA/PBS 稀釋。
5. 在室溫或 4 °C 避光至少孵育 30 分鐘。
6. 400g 離心 5 分鐘洗細胞并用冰冷 PBS 重懸，您需要根據細胞類型調整離心條件（離心力和時間）。
7. 用 3% BSA/PBS 將熒光標記的二抗稀釋到最佳濃度（參照廠家說明書），然后用此溶液重懸細胞。
8. 在室溫或 4 °C 至少孵育 20-30 分鐘，必須避光。
9. 洗滌細胞三次，每次 400g 離心 5 分鐘，并用冰冷 PBS 重懸，內含 3% 牛血清白蛋白和 1% 疊氮鈉。
10. 將細胞懸液立即放于 4 °C 避光保存。
11. 為了獲得最佳效果，應盡快進行流式細胞分析。
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