瘦素在海人酸誘導小鼠顳葉癲癇海馬損傷中的作用

摘要：

目的 探討瘦素 (Leptin) 與顳葉癲癇發生、發展過程的關系。

方法 外源 Leptin 注射 C57BL/6J 小鼠后，右側海馬微量 注射 200 ng 海人酸 (kainic acid，KA) 誘導顳葉癲癇，記錄小鼠癲癇評分，1 周后觀察小鼠海馬病理變化，包括 Western blot 檢測 Bax 的表達水平，尼式染色 (Nissl staining) 觀察海馬 Hilus 區神經元丟失，免疫熒光檢測 Hilus 區星形膠質細胞活化與 增殖。結果 在 200 ng KA 誘導的顳葉癲癇模型基礎上，10 mg/kg 外源 Leptin 預處理后，癲癇評分增加約 52%，Bax 表達水 平升高約 75%(P ＜ 0.05)，海馬 Hilus 區神經元丟失嚴重，星形膠質細胞過度活化。

結論 Leptin 增加了 KA 誘導的神經元凋 亡，加重 KA 誘導的神經病理過程。

材料和方法

1 材料　C57BL/6J 小鼠 (SPF 級，60 只 )，8 周齡， 雄性，體質量 20 ~ 22 g，購自解放軍總醫院醫學 實驗動物中心；標準飼料 (10% KJ%fat，飼料 ) ；海人酸 (kainic acid，KA)(Sigma Chemical Co. St Louis，MO，USA) ；人重組 Leptin(Peprotech公司 ) ；三羥甲基氨基甲烷 (Tris 堿 )( 北京益利精 細化學品公司 ) ；腦立體定位儀 (ZS-B/C，北京眾 實迪創科技發展有限責任公司 ) ；5μl 微量進樣 器 Microliter Syringes( 上海高鴿工貿有限公司 ) ；乙醚 ( 北京益利精細化學品公司 ) ；甲苯胺藍 (Sigma Chemical Co. St Louis，MO，USA) ；RIPA 裂解液、 BCA 蛋白定量試劑盒、Western Blot 超敏發光液 ( 北京普利萊基因技術公司 ) ；一抗 ：Bax(Epitomics 公司 )，β-actin(Santa Cruz) 膠質纖維酸性蛋白 (GFAPCell Signaling Technology Inc. #3670)、 瘦 素受體 (ObR，Santa Cruz Biotechnology) ；二抗：山 羊抗鼠 Alexa Fluor(R)488，山羊抗兔 Alexa Fluor(R) 555(1 ∶ 400，Cell Signaling Technology Inc.)、山羊 抗兔 IgG/ 辣根酶標記 ( 北京中衫金橋公司 ) ； Hochest33342(Sigma) ；檸檬酸鹽緩沖液 ( 北京普利 萊基因技術公司 )。

2 顳葉癲癇小鼠模型的建立 [5]　將 C57BL/6J 小鼠 分為 0.9% 氯化鈉注射組 ( 對照組，10 只 )，Leptin將硝酸纖維素膜放入含 5% 脫脂奶粉 (TBST 溶解 ) 塑料袋中，放入搖床 37℃封閉 1 h，將稀釋好的一 抗，Bax(1 ∶ 1 000)、β-actin(1 ∶ 500)，4℃封閉 過夜。取出后放室溫 30 min，TBS/T 漂洗膜 3 次 ×10 min，加入稀釋好的二抗 (1 ∶ 3 000)，37℃孵育 30 min，TBS/T 漂洗硝酸纖維素膜 3 次 ×10 min，加入發光液，暗室曝光。掃描后，使用 Image Plus 6.0 軟件，分析其灰度值，3 次獨立實驗求平均值。

1.尼式染色 (Nissl staining) 4 μm 石蠟切片脫蠟 至水，用磷酸鹽緩沖溶液洗 2 min，放 1% 甲苯胺 藍溶液中室溫 20 min，用梯度酒精依次脫水，結 果尼式小體呈深藍色顆粒，細胞核呈淡藍色，背 景基本無色。

1.免疫熒光雙染法觀察 ObR 和 GFAP 共表達 注射海人酸后的小鼠冠狀面石蠟切片 (4 μm) 脫蠟 至水，檸檬酸鹽緩沖溶液高壓修復 5 min，5% 山 羊血清封閉，加入一抗瘦素受體 (ObR) 和膠質纖維 酸性蛋白 4℃過夜，漂洗后，加二抗 Alexa Fluor (R) 488，Alexa Fluor (R) 555，37℃孵育 40 min，Hochest 33342 染核，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照，

癲癇是神經系統中僅次于腦血管疾病的第二 大病種，大部分可以用藥物控制，30% 癲癇患者 會發展為難治性癲癇，其中顳葉癲癇占很大部分。 顳葉癲癇常見的病理學改變是海馬硬化、萎縮、 海馬特定部位神經元丟失，膠質細胞增生 [7]。苔蘚 纖維出芽是人類顳葉癲癇的典型病理特征，苔蘚 纖維是齒狀回顆粒細胞的軸突，正常情況下苔蘚 纖維是同海馬 Hilus 區和 CA3 區錐體細胞的樹突建 立聯系，在海人酸誘導損傷的情況下，Hilus 區神 經元和 CA3 區神經元顯著丟失，苔蘚纖維與靶細 胞失去聯系，觸發苔蘚纖維異常出芽與自身胞體 和樹突形成自身反饋的興奮性突觸，另外內分子 層的傳入纖維起始于 Hilus 區神經元，Hilus 區神 經元的丟失使苔蘚狀纖維發芽構成新的傳入通路， 形成異常的自反饋，在癲癇反復發作中起到重要 作用 [8-10]，海馬 Hilus 區在癲癇的發作中也起著重 要作用。本研究采用海人酸誘導的顳葉癲癇小鼠 模型，重點觀察小鼠海馬 Hilus 區的病理變化。

瘦素是一種主要由脂肪細胞分泌并釋放入血 的多肽類激素，其可通過血腦屏障作用于中樞神 經系統調節能量代謝 [11]。近年絕大部分研究表明， 瘦素具有減輕神經損傷的作用，如在腦缺血、阿 爾茨海默病、帕金森病，谷氨酸誘導的癲癇中均 有保護作用 [12-14]。少量研究表明，高瘦素水平對 癲癇的發生具有促進作用 [15]，但是具體原因還不 清楚。根據 Lynch 等 [15] 的研究，本文章探討腹腔 注射 (10mg/kg) 瘦素在海人酸誘導的顳葉癲癇模型 中的作用以及可能的潛在機制。

本研究觀察了 Hilus 區的神經元及星形膠質細 胞在顳葉癲癇小鼠海馬損傷中的變化。在海人酸 誘導顳葉癲癇基礎上，瘦素預處理后小鼠的癲癇 行為評分增加，病理顯示海馬 Hilus 區神經元丟失 加重，可能是由于小鼠海馬內凋亡蛋白 Bax 表達 顯著升高，導致神經元抗凋亡能力下降。神經元 和膠質細胞是人腦的主要構成組分，膠質細胞數 量是神經元的 5 ~ 10 倍，其中數量最多的是星形 膠質細胞，星形膠質細胞平鋪并緊緊包裹著神經 元和血管，長期以來星形膠質細胞被認為主要對 神經元起營養和支持作用，對維持神經元外的微 環境起著至關作用 [16]。星形膠質細胞的活化與病 理刺激的嚴重程度相關，神經膠質酸性蛋白是星形膠質細胞的特異性標記物，在活化的星形膠質 細胞中顯著增加，常用來鑒別大腦損傷區與非損 傷區的星形膠質細胞 [17]。在神經元丟失后，星形 膠質細胞增殖活化既可以起到填充的作用，也可 將損失部位隔離，但過度活化的星形膠質細胞形 成的瘢痕、星形膠質細胞內谷氨酸合成酶含量降 低也是癲癇反復發作及難以治愈的重要因素 [18-19]。

本研究發現，瘦素預處理后，顳葉癲癇小鼠海馬 Hilus 區 GFAP 表達增加，星形膠質細胞過度活化， 呈現反應性星形膠質細胞形態主要表現為細胞增 生和細胞形態發生改變，包括胞體肥大變粗、突 起增加、延長、聚集成簇。外源性給予一定量的 瘦素會加重海人酸誘導的病理損傷，其可能原因 是降低神經元的抗凋亡能力，過度激活星形膠質 細胞。瘦素可能作為研究顳葉癲癇的新的切入點。