細胞培養常見問題解答（一）

1 冷凍管應如何解凍?

取出冷凍管后， 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化， 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿， 否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全， 預防冷凍管之爆裂。

2 細胞冷凍管解凍培養時， 是否應馬上去除DMSO?

除少數特別注明對DMSO 敏感之細胞外， 絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞)， 在解凍之后， 應直接放入含有10-15ml新鮮培養基之培養角瓶中， 待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。

3 可否使用與原先培養條件不同之培養基?

不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養基， 若驟然使用和原先提供之培養條件不同之培養基， 細胞大都無法立即適應， 造成細胞無法存活。

4 可否使用與原先培養條件不同之血清種類?

不能。血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源， 所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清， 在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。

5 何謂FBS, FCS, CS, HS ?

FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯誤的使用字眼，請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。

6 培養細胞時應使用5 % 或10% CO2?或根本沒有影響?

一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統，而培養基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養時應使用的CO2 濃度。當培養基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時，細胞培養時應使用10 % CO2;當培養基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時， 則應使用5 % CO2 培養細胞。

7 何時須更換培養基?

視細胞生長密度而定， 或遵照細胞株基本數據上之更換時間，按時更換培養基即可。

8 培養基中是否須添加抗生素?

除于特殊篩選系統中外， 一般正常培養狀態下， 培養基中不應添加任何抗生素。

9 附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度?應如何處理?

一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。*次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中， 保存于–20 °C，避免反復冷凍解凍造成trypsin 之活性降低， 并可減少污染之機會。

10 懸浮性細胞應如何繼代處理?

一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中， 稀釋細胞濃度即可， 若培養液太多時， 可將培養角瓶口端稍微抬高， 直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養角瓶，加入新鮮培養基稀釋至適當濃度， 重復前述步驟即可。

11 欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉速?

欲回收動物細胞， 其離心速率一般為300xg (約1,000rpm)，5 - 10 分鐘， 過高之轉速， 將造成細胞死亡。

12 細胞之接種密度為何?

依照細胞株基本數據上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。

13 細胞冷凍培養基之成份為何?

動物細胞冷凍保存時zui常使用的冷凍培養基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能，故不可將DMSO 直接加入細胞液中， 必須使用前先行配制完成。

14 DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何?

冷凍保存使用之DMSO 等級， 必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)，其本身即為無菌狀況， *次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中， 保存于4°C，避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質， 并可減少污染之機會。若要過濾DMSO， 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質濾膜。

15 冷凍保存細胞之方法?

冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80 °C 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存。

冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 °C 至–80 °C 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 °C 不可超過1 小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微

降低一些。