養細胞真的是磨練人性格的一項工作。細菌真菌支原體各種污染都經歷過了，能把癌癥細胞養到絕種也是很無奈。
生活的閱歷就是最大的智慧，所以今天跟大家匯總了細胞間常用的無菌技術操作指南如下（以下內容沒有什么具體順序，想到什么就寫什么了）：
1、我們要挑選了一個平時很少有人用的實驗室作為無菌室，超凈臺不能放在靠近門口和窗戶的位置，這個區域要保持干凈無灰塵。為保證超凈臺工作面的無菌，使用前需用75%的乙醇擦拭工作面。
2、每天實驗開始時候，超凈臺/實驗間 照20分鐘紫外是不錯的選擇。拿培養瓶和培養液時候請托下面拿，切忌不要拿瓶頸部位。
3、工作前和工作后，都要對超凈臺進行擦拭，特別是有液體溢出的地方。各種盛裝液體的瓶子從冰箱內拿出來后，都要用75%乙醇進行擦拭。為確保無菌操作，最好每次使用之前也要再進行擦拭。
4、在操作過程中，超凈臺上的所有物品需擺放整齊。整齊的原則是：需要的東西要很容易拿到，拿東西的時候不能跨越其他物體；超凈臺內的物品不宜過多，否則會影響無菌空氣的層流；實驗完畢后擦拭整個超凈臺面，并移走所有物品。
5、對于我們從試劑公司購買的培養基、血清或者其他試劑，一定是經過廠家的質量監控保證無菌的，但是盛裝試劑的瓶子外表不是無菌的。所以在實際操作中，要在超凈臺下拆下外包裝，每次使用前需用75%乙醇擦拭。（在這里提出一點疑問，有很多人說培養基和血清不能照紫外，也有人說二者是可以照紫外的，希望有大神幫忙回答一下）
6、從其他實驗室借來的細胞，因為無法保證原來的實驗室或運輸途中是否有污染情況出現，所以首先要在沒有抗生素的情況下，和本實驗室的細胞分開培養一段時間，直到證明它們沒有被污染再放到同一空間。
7、如果不是大批量培養細胞，我們會用廣口瓶配制盛裝培養基。廣口瓶特有的深螺旋蓋子防污染的效果很好，但是清洗的時候要特別注意，以防瓶蓋內殘留的液體沒有清洗干凈。
8、培養皿的敞口時間不易過長，不要在敞口的培養皿及培養皿的上方操作。當把培養皿從培養箱拿出或放入培養箱中時，小心不使它們傾斜或受到搖晃，避免培養基進入蓋子和皿身的夾縫中。如果不小心出現上述情況，應用75 % 乙醇擦掉溢出的培養基，并更換新的蓋子。
9、雖然我們在操作的過程中會帶無菌手套，穿無菌服，但是個人衛生也是很重要的一點。手部的清潔可以濕潤皮膚，洗掉一些微生物，帶走某些皮膚干屑。如果女生是長頭發，也要盤頭或馬尾系在身后。如果患有感冒，最好在感冒好之前不要進行細胞培養工作，即使帶上口罩，也不能阻擋感冒病毒。
10、玻璃吸管或塑料吸管是轉移液體最方便的途徑。滅菌前，要在玻璃吸管的吸口端加一個棉塞，這個塞子能起到防止液體回流造成交叉污染的作用。
11、污染可以從一個小范圍或一個培養皿擴散到幾個培養皿，乃至整個培養箱中。觀察培養皿中細胞狀態的時候，一定要肉眼和顯微鏡雙重仔細觀察；不能與其他實驗人員公用同一個瓶子，不同種類的細胞系哪怕培養基相同，也不能使用同一個瓶子。
12、在操作過程中，打開和關上瓶蓋的前后都需要在酒精燈火焰旁灼燒瓶口和瓶蓋。由于空氣對流的原因，在火焰旁操作，火焰旁的空氣向上走，可以減少附近區域灰塵下降。
13、超凈臺之所以會營造出一個無菌的環境，是因為里面有持續穩定的過濾氣流通過超凈臺面。水平式超凈臺的氣流是從實驗人員的對面吹出，與臺面平行。垂直式超凈臺的氣流是從頂部向下吹的臺面，被吸入后循環利用。所以對于垂直式超凈臺的實驗人員來說，操作時不要在開口的上方操作；而對于水平式的超凈臺，實驗人員盡量不要在開口的后方操作。
14、水平式超凈臺可以提供相對穩定的氣流，對培養物和試劑的無菌保護作用較強。但是垂直式給予實驗人員的保護更多。
15、在操作過程中，不要把液體從一個瓶子倒入另一個瓶子中，因為這種傾倒方式會將讓液體變成連接瓶內外空氣的橋梁。即使瓶子是無菌容器，這種方式也會增加污染的風險。
16、水浴鍋很臟，生化培養箱要是得手動加濕的話盤里的水也會很臟，勤換 (滅菌水加進去)。
17、操作時要常更換吸管，切勿一根吸管做到底。一旦發現吸管口接觸了手和其他污染物品應棄去。實驗完畢及時收拾，保持實驗室清潔整齊，最后用消毒水浸泡的紗布擦臺面。
18、離開過操作臺的東西再進操作臺之前一定要用酒精噴一遍，包括一切實驗耗材、儀器、以及你帶著手套的手。實驗結束后對實驗臺的消毒。紫外什么的，用前用后都照個 30 分鐘。
19、不管買的細胞、惠贈的細胞，剛拿到手趕緊做兩件事：檢測是否有支原體污染； 迅速擴增凍存。
20、發現有污染迅速處理掉，特別是當你養了很多種細胞時； 細菌污染，真菌污染很容易發現，支原體污染的話，細胞會長的慢，買個支原體檢測的 kit 定期檢測一下。
21、細胞只要是被細菌污染了，不管用PBS沖洗多少遍，無論是否用高濃度抗生素處理多久，只要抗生素一撤，污染的細菌必會暴發，唯一能做的就是扔掉這盤細胞。
22、非常珍貴的腫瘤細胞被細菌污染了并且沒有凍存備份怎么辦？可以嘗試小鼠皮下接種，待皮下接種成功后，取下腫瘤消化繼續培養，小鼠體內的免疫系統會清理掉細胞中污染的細菌。
23、如果細胞反復污染，記住一定不是操作問題，一定是有污染源，請仔細尋找污染源：培養基、血清、胰酶、培養瓶…，可以提取上述試劑在新的培養基中進行培養，觀察哪一組能培養出細菌。最簡單粗暴但又快捷的方法就是將所有的細胞培養的試劑和器皿換成新的。
雖然我講的內容比較枯燥，但很實用。細胞污染是非常頭疼的一件事情，祝大家細胞培養順利！
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