徠卡：探索顯微科技極限提供生命研究新工具

　　分析測試百科網訊 中國細胞生物學學會2021年全國學術大會在重慶召開。來自細胞生物學相關領域的2000余位專家、學者齊聚一堂，交流學科發展，更有眾多企業，帶來了領域前沿的創新技術。分析測試百科網采訪了徠卡生命科學應用經理方策博士，他為我們介紹了徠卡在寬場、共聚焦、納米顯微鏡、光電聯用等多款創新產品，并展望了顯微技術的發展新方向。

徠卡生命科學應用經理方策博士

　　170余年顯微成像領域創新

　　徠卡顯微系統公司創立于1849年，跨越170余年的光學研發歷史，徠卡一直專注于顯微成像，并不斷推陳出新，是一家極具創新的科技公司。徠卡品牌世人皆知，目前有四家公司共享徠卡這一歷史悠久的品牌，包括徠卡顯微系統、徠卡相機、徠卡生物系統、徠卡測量系統。徠卡顯微系統共有生命科學部門、手術顯微鏡以及工業顯微鏡三大部門。徠卡生命科學部門服務的客戶群體主要是從事生物醫學領域的基礎研究客戶，如大學、研究所、醫院的研究機構，以及生物醫藥公司等等。

徠卡生命科學展臺

　　創新產品助力細胞研究

　　本屆細胞生物學大會上，徠卡主推的是以下三大產品線的技術產品，包括THUNDER寬場高清成像系統、Tau-STED納米顯微成像系統、冷凍光電聯用系統。目前徠卡創新的THUNDER高清成像系統已能達到接近傳統共聚焦級別的成像效果，而基于共聚焦平臺的純光學STED納米顯微成像技術，借助熒光壽命成像技術的加持，已擴展到30nm級別分辨率；光電聯用系統汲取光鏡與電鏡成像兩者的優勢，能將光鏡下載網上的熒光全景位置信息，與電鏡成像進行無縫鏈接，顯著提升了電鏡下查找目標樣品的效率。

徠卡此次展會主推的三款產品

　　革新的THUNDER寬場高清成像系統

　　傳統寬場顯微鏡會受到非焦平面上那些模糊、虛化的信號干擾，無法進行三維成像。此前，人們必須使用共聚焦顯微鏡才能獲得雜志審稿人認可的清晰圖像；而現在通過THUNDER就能夠使寬場顯微圖像達到類似共聚焦的效果，輕松完成厚樣品的3D圖像采集。

HeLa細胞球成像，Alexa Fluor 568-鬼筆環肽標記細胞微絲（紅色）、YOYO 1碘化物標記細胞核（綠色）

　　THUNDER系統采用專用的硬件和軟件，能實現焦平面信號和非焦平面信號光學特征的特異識別，并通過ZL技術提取焦平面信號，得到接近于共聚焦效果的圖像，卻不需要共聚焦顯微鏡那樣的復雜操作，學習時間成本低，易于上手。同時，寬場成像有很多優點：首先是寬場顯微鏡的操作非常簡單；其次是寬場成像速度遠遠高于共聚焦；第三是寬場成像系統的光毒性比共聚焦低。值得一提的是，徠卡THUNDER是通過ZL技術實現瞬時的高分辨率寬場成像，xy分辨率最高達136nm。用戶的感受是：可瞬時獲得一張或一組高分辨率的清晰圖像，效果接近于入門級共聚焦。

　　搭載THUNDER系統的DMi8倒置顯微鏡，還可以根據客戶的高端成像需求，升級擴展Infinity TIRF（全內反射熒光）系統，以及Infinity Scanner光操作系統。TIRF技術基于全內反射原理，可做到只激發蓋玻片附近幾十到200多納米z軸范圍內的熒光信號，排除細胞質與細胞核熒光信號的干擾，所以非常適合膜蛋白、胞吞胞吐等過程的高分辨率高速成像。

　　Infinity Scanner光操作系統通過激光對樣本進行特定操作，比如通過激光對特定區域進行光刺激、組織灼燒、細胞消融、 DNA損傷、解籠鎖、熒光漂白后恢復等各種豐富的應用。方博士進一步解釋，市場上專注于成像的顯微系統紛繁眾多，但是專注于操縱細胞狀態的、專業的光操作顯微系統卻不多，光操作的應用非常廣泛，比如神經生物學領域中常用的光遺傳技術，結合光學和遺傳學的技術手段，能以非常高的時間和空間分辨率來快速地操縱細胞狀態。

搭載Infinity TIRF & Scanner的THUNDER寬場高清成像系統

　　熒光壽命加持的tau-STED純光學納米顯微鏡

　　談到徠卡的超分辨技術，方博士更是信心滿滿：在共聚焦方面，徠卡標配的LIGHTNING超分辨模塊已達到xy 120nm，z 200nm的分辨率，定義了共聚焦成像的新標準。

STELLARIS STED純光學納米顯微鏡

　　方博士進一步介紹了徠卡在超高分辨率技術上孜孜不倦的追求。STED（受激發射損耗）是獲得2014年諾獎認可的技術，而徠卡非常有先見地在2007年就推出了商品化STED產品，此后不斷推陳出新，從單色到多色，從2D到3D，從連續激光STED到白激光門控STED，從光譜維度拓展到熒光壽命維度。全新的Tau-STED，與前幾代STED產品相比，性能上已得到全方位的巨大提升，可以在更低光劑量條件下獲得更好的分辨率，可達30nm分辨率，同時對活細胞的成像更加溫和，由于Tau技術的加持，STED圖像的信噪比也得到了質的飛越。

23nm Gattabeads 共聚焦與Tau-STED成像對比

　　STED是目前市場是唯一一種通過純光學的方法來實現超高分辨率成像的技術。與單分子定位顯微技術相比，徠卡STED的制樣也更簡單，成像速度更快，用戶使用更方便，大幅擴展了納米顯微鏡的應用范圍。

　　光電聯用系統

　　極致分辨率成像方面，徠卡提供獨具特色的光電聯用系統，方策博士介紹了其原理。相比光鏡，電鏡的分辨率更高可達到埃級別，但只能觀察很小的視野，難以快速找到感興趣的細胞區域。這時可以借助光鏡系統，因為光鏡可以通過熒光標記快速找到陽性區域，然后通過光鏡、電鏡下的位置關聯，快速找到感興趣區域來進行高達埃級別分辨率的電鏡成像，大大提高電鏡成像的效率。冷凍電鏡的采購和使用成本都很昂貴，傳統的工作流程會浪費大量的機時在尋找樣本上。徠卡與業界領先的Thermo Fisher電鏡廠商共同聯合開發的光電聯用系統，能大大提高電鏡實驗的效率。

冷凍光電聯用系統THUNDER Imager EM Cryo CLEM

　　具體的操作方法是：在電鏡所需載網上培養細胞，先用THUNDER光鏡進行熒光高分辨率成像，并對整張銅網進行大圖拼接，并標記下感興趣的細胞區域，并存儲下圖像的所有位置信息。通過硬件和軟件無縫整合，將樣品轉移至冷凍電鏡中，快速找回標記區域，進行高分辨率的電鏡成像。

　　助力抗擊疫情

　　2020年，在新冠疫情的最早期，科研工作者們急需對這種未知的病毒進行精細的結構觀察，以鑒定出病毒的種類。采用電鏡對病毒形態結構進行觀察是必不可少的。而徠卡在電鏡制樣方面非常有優勢，包括超薄切片設備及冷凍電鏡制樣設備，可以幫助客戶快速制備出合適的樣品進行高分辨率的電鏡觀察。方博士特別提到，徠卡的應用專家在疫情早期即到科研單位，幫助研究者進行電鏡制樣，進行病毒的三維結構觀察，為抗擊疫情做出貢獻。當鑒定出病毒類型之后，需進一步研究其侵染、致病機制，徠卡的活細胞工作站也在其中也發揮著重要的作用，可觀察細胞在病毒侵染過程中的形態變化，從而了解病毒侵染的機制，以及各類藥物在抗病毒過程中發揮的作用。

　　Tau：見所未見，推開顯微成像新世界的大門

　　方博士在談到徠卡的新產品規劃時表示，徠卡將不斷探索顯微成像的極限，為客戶提供更先進的研究工具。他特別要提到的是新的STELLARIS共聚焦系統擴展了Tau熒光壽命成像新模式--TauSense，為科學研究打開一扇新的大門。TauSense工具提供一種全新的成像觀察維度，相對于傳統的熒光光強成像，熒光壽命成像有許多優勢。TauSense成像模式從熒光壽命的維度觀測熒光信號，不受淬滅干擾、同染色濃度和激發光的強弱均無關，因此可以排除傳統熒光亮度成像存在的各種缺點，大大提高生物實驗的可重復性。同時TauSense也借助生物體自發熒光的熒光壽命差異來進行不同組分的分離、細胞代謝狀態的檢測，以及組織癌變的鑒定。我們希望能推動TauSense這項新技術在生物醫學研究中的廣泛應用。

植物組織的TauSense熒光多組分拆分

　　熒光壽命的應用非常廣泛，能與單光子、STED、多光子等各類成像技術相結合。首先在單光子方面，Tau可以幫助徠卡的白激光共聚焦實現FLIM-FRET，從而對10 nm內的蛋白質的相互作用開展研究。其次在STED方面，Tau可進一步提高其分辨率以及圖像的信噪比，可實現更溫和的、活細胞超高分辨率成像。第三，Tau助力多光子活體成像，由于多光子經常能激發出活體動物的自發熒光，可以通過這些自發熒光來監測細胞的代謝環境變化、包括組織是不是有癌變，是不是有其它狀態的改變，幫助多光子實現更多信息的成像。

實現“TauSense”新成像模式的STELLARIS共聚焦平臺

　　從活細胞成像到活體成像

　　近年來，活細胞工作站市場熱度很高，徠卡在細胞大會上也展出相應產品，方博士談到其原因時說：生命科學顯微成像的技術發展，是從固定細胞做到活細胞成像，從固定組織切片逐漸做到活體成像的趨勢。徠卡的活細胞工作站既可以搭載在THUNDER寬場顯微系統，也可以搭載在STELLARIS特色的白激光共聚焦顯微系統上。徠卡創新的白激光系統能很好的滿足低光毒性活細胞成像需求。

徠卡展出的活細胞工作站

　　方博士詳細介紹了白激光共聚焦。活細胞成像最大的難點是光毒性的控制，需考慮長時間拍攝是否會對細胞狀態產生影響。徠卡通過以下幾項技術來做到全面保障。首先是熒光激發效率的提升，徠卡共聚焦可搭載獨有的白激光光源，激光譜線自由可調，能保證所有染料達到100%激發效率，因此可降低激光的使用強度，更好地保護細胞。其次，STELLARIS白激光更將激發波長擴展到了790nm，可使用更長波長的染料，激發波長越長，能量越低，對細胞的損失也更小。再者，是檢測器靈敏度的全面提升，徠卡采用HyD混合型檢測器全面替代傳統PMT檢測器，大幅提升量子檢測效率，又能再次降低激光的使用強度，把激光對細胞的損傷降到更低。徠卡從激光光源、光路、檢測器等全方面的整體效率提升，從而能保證更低光毒性、更長時間的活細胞動態觀察。

搭載白激光和活細胞工作站的STELLARIS共聚焦系統

　　除此之外，徠卡還提供獨特的活體成像系統，創新的光譜式多光子DIVE DM8活體深度成像解決方案。活體成像的動物可從小鼠、大鼠等小型模式動物，擴展到非人靈長類等大型動物。據悉，目前已有中國客戶訂購了徠卡全球首臺DIVE光譜式多光子非人靈長類活體成像系統。生命科學研究的終極目標是為了改善人類生命健康，提高生活品質。傳統小型的模式動物，在基因層面和生理結構方面都與人體都有著巨大的差異，和人最接近的是非人靈長類，在研究諸如神經系統相關的許多疾病時，人類的很多疾病在小鼠身上無法造模，所以更好的研究模型是非人靈長類疾病模型。徠卡可為這類大動物活體成像客戶提供定制化的設計和服務。

STELLARIS DIVE DM8大動物光譜式多光子活體深度成像系統

　　徠卡于4月8號啟動了上海客戶體驗中心，體驗中心覆蓋了寬場、共聚焦、超高分辨率、電鏡制樣等全系列產品線，5月份即將到位一臺全新的STELLARIS Tau-STED納米顯微成像系統。徠卡希望帶給中國客戶最好、最新的技術體驗，幫助研究者嘗試各種最新的技術，為中國的科研助力。

徠卡上海客戶體驗中心

　　關于徠卡顯微系統

　　徠卡顯微系統是全球顯微科技與分析科學儀器領域的專業廠商，總部位于德國維茲拉（Wetzlar, Germany）。主要提供顯微結構與納米結構分析領域的研究級顯微鏡等專業科學儀器。自公司十九世紀成立以來，徠卡以其對光學成像的極致追求和不斷進取的創新精神始終得到業界廣泛認可。徠卡在復合顯微鏡、體視顯微鏡、數碼顯微系統、激光共聚焦掃描顯微系統、電子顯微鏡樣品制備和醫療手術顯微技術等多個顯微光學領域都取得了傲人的成績。

　　自創立至今，徠卡的光學足跡已遍及全球 100 多個國家。目前，徠卡在歐洲、亞洲與北美有 7 大產品研發中心與 6 大生產基地，在 20 多個國家設有銷售或服務支持中心，以及遍布全球的經銷商服務網絡。