干細胞：細胞重編程的黑匣子

　　“黑匣子”（Black Box），學名是飛行數據記錄儀，是飛機專用的電子記錄設備之一，可以記錄飛機飛行期間的詳細信息資料。

　　回首2014年，找不到“黑匣子”的馬航（MAS）在12月15日告別吉隆坡股票交易所，結束為期29年的上市生涯。這一天，恰好也是韓國科學家黃禹錫的生日。

　　看到上述開頭，你是不覺得這篇文章將黃禹錫和馬航牽扯到一起很無厘頭？請說NO！

　　因為最近加拿大科學家等研究者共同發現了“模糊細胞”（fuzzy，F細胞）被科學界稱之為“Project Grandiose”（重大突破），《自然》雜志（Nature）也發表了一篇題為“干細胞：細胞重編程的黑匣子”的綜述。本文是筆者讀過原文后與自己的知識體系整合出幾點感想總結。

　　約翰·格登為細胞重編程奠定理論基礎

　　2006年科學家研究細胞重編程熱情高漲

　　1996年7月5日，英國科學家伊恩·維爾穆特博士用一個成年羊的體細胞成功的克隆出了一只與它的“父親”一模一樣小羊Dolly。長久以來，科學家認為將細胞分化到胚胎狀態的細胞重編程技術在創造體內所有的細胞具有非凡的能力。

　　1998年11月，威斯康辛州的科學家們宣布他們培育出了人體胚胎干（hES）細胞，這種細胞有潛力在體內發育成任何細胞類型。胚胎干細胞的多能性（pluripotency）為發育生物學和醫學研究提供了很多可能的應用，但也帶來一些問題。因為提取干細胞通常會毀壞胚胎，因此這項研究引發了生物倫理的激烈討論，包括美國在內的很多國家都頒布了政治決策限制科學家對人體胚胎干細胞的研究。

　　2002年，當我第一次接觸到中學生物教材時，老師告訴我“20世紀50年代， 英國發育生物學家約翰格登等研究發現蝌蚪成熟分化細胞的細胞核移植進入卵母細胞質后，能發育為成熟成體青蛙”、“1996年，英國愛丁堡羅斯林研究所胚胎學家伊恩維爾穆特，第一個研制出通過無性繁殖技術產生克隆羊多莉”……

　　那時的我還不懂得什么是“核移植”、什么是“細胞重編程”，聽著老師在講臺上的嘮叨“分化細胞能通過重編返回胚胎狀態，胚胎狀態的細胞能產生所有細胞甚至個體”，而我悄悄地在對著課本上可愛的克隆羊多莉發呆。

　　2004年，那年我14歲，聽著老師跟我們很前衛地介紹細胞研究的最新成果：韓國科學家能用體細胞核轉移技術、從各種疾病（如I型糖尿病、脊髓損傷和先天性免疫缺陷癥）患者身上造出了新的干細胞。而緊接著的幾天里，新聞里在循環播放韓國科學家黃禹錫的“干細胞研究”屬于學術造假事件，在當時，為患者量身定做干細胞仍然遙不可及。

　　2006年，日本的研究人員將4個基因導入在培養皿中生長的小鼠尾部細胞，得到了外表和作用與胚胎干細胞極其相似的新細胞，并把這些新細胞稱作誘導多能干（iPS）細胞，并被他們成為一個能避開人體胚胎干細胞實際與倫理問題的可能方法。主導這項研究的就是后來我們熟悉的山中伸彌教授，其在iPS細胞領域的研究讓每一個干細胞研究者望塵莫及。

　　2007年，日本研究小組和兩個美國研究小組將把細胞再編程技術應用到了人體細胞上，被選為《科學》雜志（Science）2007年十大科學進展第二名，這一成果為新研究又打開了一扇大門。

　　2008年，《科學》雜志（Science）評出的“年度十大科學進展”，細胞重編程（cell reprogramming）被評為第一位，使得這項研究幾乎在一夜之間開啟了一個生物學的新的領域，并有望成就挽救生命的醫學上的進步。

　　2012年，山中伸彌教授和約翰戈登（約翰·格登在上世紀60年代通過核移植也成功讓蝌蚪體細胞脫分化為細胞重編程奠定了理論基礎）共同獲得了諾貝爾生理或醫學獎。

　　2014年12月，加拿大Lunenfeld-Tanenbaum研究所牽頭的國際研究團隊，日前以兩篇Nature三篇Nature Communications的形式公布了細胞重編程研究Project Grandiose的最新成果：他們打造出來一種新型小鼠多能干細胞——F細胞。

　　什么是細胞重編程？

　　干細胞作為一種未充分分化，尚不成熟的細胞，具有再生各種組織器官和人體的潛在功能，醫學界稱為“萬用細胞”。在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞：根據干細胞所處的發育階段分為胚胎干細胞和成體干細胞；根據干細胞的發育潛能分為能干細胞、多能干細胞和單能干細胞（專能干細胞）。

　　細胞重編程（Reprogramming Cells）指的是分化的細胞在特定的條件下被逆轉后恢復到全能性狀態，或者形成胚胎干細胞系，或者進一步發育成一個新的個體的過程。

　　2008年，研究人員在用活鼠做的一項漂亮的研究中，他們讓細胞直接從一種成熟細胞變成另一種，打破了細胞單向發育的規則，這為細胞重編程方面取得了又一個里程碑式的進展，并把細胞重編程這個現在蓬勃發展的領域推到了《科學》2008年十大科學進展之首。

　　為什么說干細胞是細胞重編程的黑匣子？

　　最初的細胞重編程方法靠病毒把再編程基因插入受感染細胞的基因組，從而永久地改變其DNA。但科學家們對這種方法比較擔心，因為第一，插入的基因可能會打斷現有的基因，例如防癌基因，導致細胞容易形成腫瘤；第二盡管插入的基因似乎在再編程結束后自動關閉、讓細胞自身的基因接管，科學家們仍然擔心插入的基因會再激活或者對細胞產生其它微妙的影響；第三細胞再編程需要更好的質量控制。

　　鑒于以上三點，世界各地的實驗室都在尋找其它方法來引發細胞重編程。

　　賓西法尼亞大學細胞生物學家Ken Zaret對誘導早期48小時內這些分子的細胞內分布進行研究發現，這些分子竟然因為染色體結構變化導致和常規目標調節基因被物理阻斷，這些分子轉向調節其他可調節區域的基因，有時它們能激活迫使細胞自殺的基因，有時這些分子激活參與重編程過程的基因。因此MIT干細胞學家Rudolf Jaenisch將“山中因子”調侃為“濫交因子”。

　　這說明重編程過的細胞內部到底發生了什么仍然是個謎，似乎一些偶然事件的組合決定了哪些少數細胞最終會被重編程。目前一個主要理論認為：某些再編程因子首先幫助松動細胞核內的DNA，使重新激活關閉的基因變得更容易。隨后其它因子幫助引發一個給細胞新身份的蛋白信號級聯發生， 在分化為具體成熟細胞時，需要不同作用或不同的分子作用。

　　美國研究小組曾設法找到了一種極妙的方法，讓科學家們可以在控制更嚴格的條件下研究細胞重編程的過程。他們制造了細胞，其中的再編程基因可以通過加入抗生素強力霉素來啟動。然后，他們用重編程過的細胞生成基因完全一致的“第二代”iPS細胞，每個都含有相同的病毒插入體。這些細胞允許科學家們可以第一次在標準化條件下研究再編程的過程，助力揭示了能讓成熟細胞在單向發育道路上找到出口的生物化學過程。

　　2011年哈佛大學干細胞學家Alexander Meissner小組發現一種能促進基因表達的組蛋白修飾H3K4me2在1000多個基因組位點發生了變化，其中許多涉及多潛能基因，而許多涉及成熟（成纖維）細胞的特定基因則相應減少，細胞的行為特征也發生了改變。Meissner說，開始認為這些因子導致了混亂，研究表明這一過程是有規律的，能夠進行預測。

　　現在它們能明確哪個基因開始被激活，哪個可能被修飾，哪個將保持沉默。雖然對早期基因表達能夠準確預測，但對下一步的細胞走向仍然無法預測。有的細胞表達新基因，但無法預測。即使H3K4me2修飾的細胞也只能到后期才會發生大量重編程特征基因表達，大部分細胞只能達到部分重編程狀態，科學家仍然不清楚這個道理。

　　以色列雷霍沃特魏茨曼科學研究所的干細胞生物學家Jacob Hanna表示：盡管現在我們可以制作iPS細胞，且能夠區分出其與普通細胞的差異，但是我們仍然覺得，我們對干細胞的認知還不足以控制細胞分化過程。

　　科學家將被稱為“山中因子”的蛋白引入細胞會導致一系列基因表達，幾天后這些細胞進入一個奇怪的狀態，此時細胞分裂但似乎穩定，幾周后，大約0.1%的細胞變成了多能干細胞。這個過程無法預測，科學家甚至不清楚那個細胞具體何時啟動了重新編程過程。

　　科學家既不知道為什么誘導干細胞必須很長時間的等待，也不清楚為什么這種轉變的比例那么低。山中伸彌教授認為細胞在分裂過程中，成熟細胞開始仍然習慣于表達原來的基因，雖然少數細胞能快速發生變化，也必然受到來自周圍環境細胞的影響，導致這些細胞發生搖擺不定的分裂。培養細胞一般會出現各種不同的類型，外來基因產生的影響也必然不同，對這種細胞有效的基因，未必對其他細胞都有作用，他認為希望產生快速誘導的愿望也許根本不可能實現。

　　顯而易見這屬于誘導干細胞的黑匣子步驟：目前完全理解這一過程似乎不可能。

　　2014年：黃禹錫的“造假夢”成真 iPS細胞進入臨床應用

　　2006年，韓國科學家表示能用體細胞核轉移技術、從各種疾病（如I型糖尿病、脊髓損傷和先天性免疫缺陷癥）患者身上造出了新的干細胞，而這一研究在當時因證據不足被視為“學術造假”。

　　為了使細胞重編程足夠安全、能用于細胞療法，研究人員必須找到一種高效、可靠的方法來引發細胞重編程。他們還要確切地搞清楚這個過程是如何進行的。科學家對細胞重編程的熱情在高漲，由于細胞重編程種操作方法非常簡單，幾乎所有的實驗室都可采用了這一技術，現在每年在這方面的論文超過1000多篇。

　　今年9月份，日本女科學家理化學研究所高橋政代讓這一理論研究變為了現實，是干細胞由基礎研究向轉化醫學的里程碑，這是人類首次將重組后的細胞移植到人類身上。

　　細胞重編程技術用于臨床的擔憂：低分化的細胞一旦進入了人體怎么辦？

　　盡管 iPS細胞已經在日本進入臨床應用，但是之前的疑問仍然存在，盡管許多科學家蜂擁而至般地研究細胞重編程，他們知道細胞如何分化出干細胞，但是他們并不知道在這一過程中的原理。

　　日本京都大學iPS細胞研究和應用中心的分子生物學家Knut Woltjen 表示：盡管我們嘗試了用各種方法通過黑匣子，但是這其中的過程真的很混亂很負責，到底發生了什么真的很難弄懂。

　　干細胞生物學家認為，誘導開始階段會出現多種細胞類型，一方面這一過程無法獲得足夠多的誘導干細胞，另一方面這些細胞中只有少部分能完全發生重編程，同時這些細胞也有可能發生逆轉，需要科學家仔細調整培養條件才能獲得理想效果，這正是誘導干細胞領域存在的一個困難，因為不同的實驗條件可能會產生不同的結果，也給這種技術應用的安全性帶來隱患。

　　因此，將分化出的干細胞通過細胞重編程誘導生成全能細胞時，如果遇到的是低分化的細胞將如何是好？

　　Project Grandiose：助力細胞重編程過程走向安全有效的應用

　　隨著技術的進步，越來越多的技術開始助力觀察圖片。通過對單個細胞進行細致分析，積累了大量的詳細的分子數據，生物學家可以更加深入觀察細胞重編程過程中的一些重要事件。

　　最近發表在《自然》雜志上的一系列研究論文試圖克服這一困難，科學家通過單細胞分析技術，確定了細胞誘導過程的一些關鍵分子事件，這是一項巨大的工程。由一個被稱為“Project Grandiose”國際合作項目完成。

　　Project Grandiose涉及來自領先實驗室的50名干細胞生物學和基因組技術專家，包括ANU）、悉尼大學、昆士蘭大學、Victor Chang心臟研究所和QIMR Berghofer醫學研究所。該組織關注重編程過程（稱為表觀基因組學、轉錄組學和蛋白質組學）的不同分子水平，識別哪些基因組合及其活性在中途改變。

　　加拿大多倫多西奈山醫院干細胞生物學家Andras Nagy是該國際合作項目的負責人，他表示：將這項研究稱為重大突破一點兒也不過分，因為這是第一次對誘導干細胞不同階段進行的超精細分子動態描述。

　　科學家可以制造誘導干細胞，也可以讓他們分化，但是精確控制這些過程十分困難。這正是獲得足夠理想的治療用干細胞方面的技術難關。能實現這一技術當然是科學家夢寐以求的，為達到這一目的，首先要了解這些過程的內在分子特征，現在的研究結果給科學家向這一目標研究提供了重要基礎。

　　Nature雜志及其子刊發表的系列論文代表了一項全球性工作，試圖描述重編程期間不同細胞大分子類型的變化，并描述基因調控不同層次的模式。然而，在數據庫中有更多問題有待發現和進一步探討，現在通過stemformatics.org（澳大利亞干細胞協作平臺），數據庫是公開可用的。因此全球涌現出很多研究，以便更好地理解iPS細胞重編程，因為它可能有助于避免胚胎來源細胞的道德敏感使用。

　　Preiss教授說：“使重編程成為一個安全有效的過程，因此所產生的干細胞就可以廣泛應用于治療，相關研究工作已經相繼開始。”經過標記重編程過程，這些科學家連續1月每天收集1億個細胞，然后分析這些細胞的蛋白、RNA，掌握甲基化修飾等信息。甲基化修飾分析會產生海量數據，然后用超大硬盤分發給合作者。

　　這一合作研究獲得了一個非常重要的成果，他們確定了一種新的誘導干細胞類型F-class，意思是fuzzy模糊細胞。胚胎中能分離到胚胎干細胞和外胚層干細胞。F-class細胞和這些細胞具有不同的特征，也不同于誘導干細胞。傳統重編程方法中，達到多能性后宿主細胞表達的因子能沉默重編程因子。然而，F-class細胞的維持依賴于轉錄因子持續性的高表達。因為這種細胞無法滿足最嚴格的干細胞測試，將這種細胞注射到小鼠胚胎無法產生嵌合體小鼠。有人認為不能算干細胞，最多只能算部分重編程細胞。Nagy認為雖然不能形成嵌合體小鼠，但能形成畸胎瘤，這種結構中存在多種細胞類型。

　　科學家現在希望將細胞進行分類以分析這個誘導過程的黑匣子。Woltjen研究發現，不同比例的重編程誘導因子能產生不同的誘導效率，一種配方有很高的誘導重編程效率，但是大多數細胞都是部分重編程的不穩定狀態，難以獲得最終理想誘導效率。而誘導重編程效率比較低的配方最終獲得更高質量的誘導干細胞。

　　Nagy 認為這一發現好像是打開了一扇大門，應該存在更多類似的干細胞狀態。