DNA柔性在抗體基因超突變中的生理功能新進展

4月24日，《細胞》（Cell）以Research Article的形式，在線發表了中國科學院分子細胞科學卓越創新中心孟飛龍研究組等撰寫的題為Mesoscale DNA Feature in Antibody-Coding Sequence Facilitates Somatic Hypermutation的最新成果。該研究基于經典生化方法與高通量測序技術，建立了體外檢測抗體基因超突變的一系列新方法，從而揭示了抗體基因互補決定區（CDR）通過高度柔性特征引發超高突變的分子機理。胞苷脫氨酶AID在B淋巴細胞中啟動了抗體基因超突變，其蛋白表面具有大片正電荷片區；而抗體基因CDR編碼區域DNA序列則在進化中獲得了高度柔性的特征。酶與底物的協同進化共同促進了CDR區的超突變偏好。該工作為下一代抗體基因人源化動物模型的設計提供了底層理論。

　　抗體作為適應性免疫系統中的關鍵效應分子，時刻守衛著機體的健康。面對復雜多變的外界環境，機體的免疫系統通過抗體多樣化機制產生數量龐大的抗體分子，從而特異性地識別和清除病原體。抗體多樣化通常包含兩個主要步驟：一是核酸內切酶RAG介導的的V(D)J重排過程，二是胞苷脫氨酶AID起始的體細胞超突變（SHM）和抗體類型轉換（CSR）過程。體細胞超突變可在抗體基因的可變區編碼區引入高頻突變。然而，超突變在抗體可變區外顯子上并非均勻分布，而偏好性積累在可變區中的互補決定區（CDR）。超突變為什么具有偏好性，這是免疫學家David Baltimore與Klaus Rajewsky在20世紀80年代提出的問題。近40多年來，該領域的科學家嘗試從多個角度去解釋這一現象，但尚未有令人信服的結論。CDR偏好突變科學問題的解決亟需引入新的概念。胞苷脫氨酶AID是一個僅含198個氨基酸的蛋白質。生化實驗證明，AID作用于單鏈DNA底物，且偏好作用于WRC(W=A/T, R=A/G)基序。然而，WRC基序不能解釋抗體基因CDR偏好超突變，這是由于同樣的WRC基序在CDR編碼區突變率超高。在CDR編碼區的中尺度（5-50bp）中，AID可能受到局部序列的調控。

　　孟飛龍研究組長期致力于免疫受體多樣化機制研究。在最新研究中，科研人員從經典的生化方法出發聯合高通量測序技術，建立了體外檢測抗體基因突變的新體系，發現了AID酶活反應重現小鼠體內抗體基因突變譜式。進一步，該研究將生化實驗的DNA底物擴展到27種有頜脊椎動物的1000余條抗體基因序列，發現CDR突變偏好在使用體細胞高頻突變（SHM）作為抗體主要多樣化策略的四足動物（包括人、恒河猴、食蟹猴、小鼠、大鼠、狗、鴨嘴獸以及羊駝等）中高度保守。那么，這種突變偏好是否受DNA序列上下文的影響？

　　為了回答上述問題，研究人員在小鼠體內將一段抗體基因的DNA序列進行隨機置換，發現序列改變后突變頻率發生了顯著變化。這提示不同的DNA序列上下文中可能含有未知的中尺度順式因子，從而調控突變頻率的作用。因此，研究通過基因編輯在CDR3區引入隨機序列改變，快速獲得十幾種攜帶不同CDR3序列環境的小鼠模型，發現了序列改變越靠近CDR3區內的突變熱點對該位點的突變頻率影響越大。因此，研究繼續將序列上下文范圍縮小到突變位點上下游各12-15 nt。

　　通過分子動力學模擬和多種單分子生化實驗，研究發現中尺度中DNA序列柔性越大越利于結合AID表面的正電荷片區，進而越有助于突變的發生。單鏈DNA的柔韌性與嘧啶-嘧啶二核苷酸的含量呈正相關。此外，通過分析抗體基因序列特征以及突變譜式，研究發現抗體基因CDR的編碼序列在進化中獲得了高度柔性的特征。科研人員分別在B細胞系和小鼠體內將一段柔性序列插入突變低頻區FR，發現柔性序列提高了FR的突變頻率。

　　綜上，該研究解答了長期困擾這一領域的難題，發現了抗體基因CDR編碼區DNA柔性促進偏好性突變的發生以及抗體基因編碼序列具有調控AID突變靶向的非編碼功能。這一工作為DNA力學性質參與調控細胞生命過程中提供了例證，并提示DNA柔性等力學性質可能在其他生命活動如腫瘤的發生發展中發揮重要作用。中尺度序列特征的發現，為設計下一代抗體基因人源化動物模型構筑了底層理論。

　　該研究由分子細胞卓越中心和上海交通大學醫學院合作完成。上海師范大學科研人員在數據分析，上海交通大學科研人員在分子動力學模擬，美國哈佛大學科研人員在模型構建等方面作出了重要貢獻。研究工作獲得國家自然科學基金、科技部、中科院、上海市科學技術委員會等的資助，并得到上海交通大學、美國哈佛大學醫學院、中國農業大學、瑞典卡羅林斯卡研究所、中科院杭州醫學所、中科院生物物理研究所和復旦大學等的科研人員以及分子細胞科學卓越創新中心動物實驗技術平臺、細胞分析技術平臺和分子生物學技術平臺的支持。