細胞傳代實驗

實驗方法原理 培養細胞傳代根據不同細胞采取不同的方法。貼壁生長的細胞用消化法傳代；部分貼壁生長的細胞用直接吹打可傳代；懸浮生長的細胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打傳代。

實驗材料 細胞

試劑、試劑盒 D-Hanks液小牛血清RPMI1640雙抗胰蛋白酶EDTANHClNaHCO3

儀器、耗材 凈化工作臺離心機恒溫水浴箱冰箱倒置相差顯微鏡培養箱吸管玻璃瓶培養瓶廢液缸吸頭槍頭膠塞離心管量加樣槍 紅血球計數板

實驗步驟

1.  貼壁細胞的消化法傳代：

（1）吸除或倒掉瓶內舊培養液。

（2）D-Hanks液洗2～3次。

（3）向瓶內加入適量消化液（胰蛋白酶或與EDTA混合液）輕輕搖動培養瓶，使消化液流遍所有細胞表面。

（4）然后吸掉或倒掉消化液后再加適量新的消化液，輕輕搖動再倒掉大部分消化液，僅留少許進行消化（也可不采用上述步驟直接加消化液進行消化）。

（5）消化最好在37℃或室溫25℃以上環境下進行。

（6）消化2～5 min 后把培養瓶放置顯微鏡下進行觀察，發現胞質回縮，細胞間隙增大后，應立即終止消化。

（7）吸除或倒掉消化液，如用EDTA消化，需加Hanks液數毫升，輕輕轉動培養瓶把殘留消化液沖掉。

（8）再加培養液。如僅用胰蛋白酶可直接加少許含血清的培養液，終止消化。

（9）用彎頭吸管，吸取瓶內培養液，反復吹打瓶壁細胞，吹打過程要順序進行。

（10）從培養瓶底部一邊開始到另一邊結束，以確保所有底部都被吹到，使細胞脫離瓶壁后形成細胞懸液。吹打時動作要輕柔不要用力過猛。 

（11） 計數，分別接種在新的培養瓶內。

2.  懸浮細胞的傳代：懸浮細胞傳代可離心收集細胞后傳代，或直接傳代。

離心傳代法：

（1） 將細胞連同培養液一并轉移到15 ml 離心管內。

（2） 離心800~1000 rpm，5 min。

（3） 棄去上清，加新的培養液到離心管內，用吸管吹打形成細胞懸液。

（4） 計數，分別接種在新的培養瓶內。

（5）直接傳代即讓懸浮細胞慢慢沉淀在瓶底后，將上清液吸掉1/2~2/3，然后用吸管吹打形成細胞懸液后再傳代。

3.  部分貼壁細胞的傳代

（1）部分貼壁不牢的細胞，如Hela細胞等，不經消化處理直接吹打可使細胞從壁上脫落下來，而進行傳代。

（2）對絕大部分貼壁生長的細胞，因直接吹打對細胞損傷較大，細胞常有較大數量的丟失，因而需消化后，才能吹打傳代。

注意事項

1.  胰蛋白酶要預溫，溫度37℃左右為宜℃。

2.  離心轉速要合適，轉速過低，不能有效分離細胞，離心速度過大，時間過長，會擠壓細胞造成損傷甚至死亡。

3.  要定時觀察細胞，發現污染，應及時處理。