臘肉香腸中苯并芘的檢測

【HPLC結合在線固相萃取對苯并芘進行測定】

本文利用雙三元液相色譜儀，通過在線固相萃取建立臘肉香腸中苯并[a] 芘的檢測方法，在現行國家標準基礎上，進一步簡化前處理方法、并確保分析過程更加靈敏、快速、準確。

苯并[a] 芘(英文縮寫BaP)屬多環芳烴類化合物，是一種常見的高活性間接致癌物質(結構式見圖1)。

圖1. 苯并[a] 芘化學結構圖。

食物中的BaP 通常源自加工過程，當食材經高溫處理時，所含的氨基酸和油脂類成分可通過裂解或熱聚合生成BaP，若加工溫度較高(如400 ~ 1000 ℃)，BaP 生成量將會急劇增加。由于臘肉、香腸等制品通常會經過烘烤或煙熏處理，生成BaP 的可能性相對較大，因此需要對其所含的BaP 加以嚴格控制。目前我國國標限定糧食和肉制品中Bap 的殘留量應在5 μg/kg 以下，相應的國家標準及文獻方法如表1 所示。

表1. 肉類產品中苯并[a] 芘的前處理方法

經比較發現，上述方法的前處理過程均較為繁瑣，耗時較長，不便于大量樣品的快速檢測。本方法使用雙三元高效液相色譜系統(DGLC-3600)，采用在線固相萃取(Online SPE)技術，首先將樣品中難洗脫的動物油脂等成份保留在富集柱上(在線凈化)，然后通過切換閥將易洗脫的目標物轉入分析柱進行HPLC 分離，從而有效降低基質成份對目標物的干擾。該方法可實現樣品自動化前處理，方法快速簡便(測試周期約為30 min)，靈敏度高(檢測

限按供試品取樣量折算可達0.15 μg/kg)，且精密度和回收率好，適于大批次樣品的快速檢定;SPE 小柱可在分析過程中在線凈化，重復使用，大大節省測試成本

材料與方法

儀器

高效液相色譜儀(Thermo Scientific Dionex Ultimate DGP 3600系列，包括有帶在線脫氣單元的雙三元梯度泵，自動進樣器，帶有一個六通閥的柱溫箱，熒光檢測器，儀器連接參見圖2。)

超純水機(Thermo Scientific GenPure Pro UV-TOC，P/N：50131948)

臺式離心機(Thermo Scientific Sorvall ST16，P/N：75004240)

旋轉蒸發儀(Thermo Scientific RV10 V，P/N：IKA8022525)

勻漿機(Seward Stomacher 80，P/N：SWD0080/000/EU)

試劑和對照品

甲醇(色譜純，Fisher Chemical，P/N: A452-4)

乙腈(色譜純，Fisher Chemical，P/N: A998-4)

乙酸乙酯(色譜純，Fisher Chemical，P/N: E195-4)

無水硫酸鈉(分析純，Fisher Chemical，P/N: S429-500)

苯并[a] 芘標準品(Dr. Ehrenstorfer GmBH，99.6 %)

標準品溶液制備

稱取苯并[a] 芘標準品 5.39 mg，置100 ml 棕色量瓶中，以甲醇溶解定容至刻度;再精密量取該溶液1.0ml，以甲醇稀釋定容至50ml，作為標準品儲備液(濃度1.074 μg/ml)。取標準品儲備液以甲醇逐級稀釋為濃度分別為53.89、10.74、5.376、1.068、0.534、0.107 ng/ml 的標準工作溶液。

樣品溶液制備

取樣品，以絞肉機攪碎混勻后，準確稱取2.0 g，加入無水硫酸鈉2.0 g，置50 ml 離心管中，先后以乙酸乙酯20 ml 均質提取2 次，每次1 min，然后于8000 轉/ 分下離心2 min;合并兩次上清液，于55 ℃下旋轉蒸發濃縮至2 ml 以下，以乙酸乙酯轉移至10 ml 量瓶，定容至刻度，過0.45 μm 有機濾膜后待測。

加標溶液制備

取攪碎后樣品2.0 g，準確加入1ml 標準品溶液，氮氣吹干后，照樣品溶液制備法“加入無水硫酸鈉2.0 g…”及后續方法操作，即得。

色譜條件

分析柱：Acclaim Phenyl-1 3 μm，4.6 ×150 mm(P/N: 071969，S/N: 001059);

富集柱：Acclaim C8 5 μm，4.6 ×10 mm(P/N: 069696，Lot No: 101111);

流動相：流動相組成見表2;富集泵梯度及閥切換條件見表3;

流速：富集泵1.0 ml/min;分析泵1.0 ml/min;

進樣量：10 μl;

柱溫：35 ℃;

熒光檢測器：激發波長290 nm，發射波長410 nm，靈敏度 1;

圖2. 儀器連接圖。

表2. 淋洗液組成及流速

表3. 富集泵( 左泵) 梯度淋洗條件

結果與討論

標準品色譜圖(1.068 ng/ml)

圖3. 標準品測定色譜圖。

樣品及加標樣品色譜圖(加標量為 5 μg/kg)

圖4. 樣品及加標樣品測定色譜圖(上- 樣品;下- 加標樣品)。

樣品前處理方法優化

分別采用乙腈、異丙醇、乙酸乙酯、正己烷對樣品進行提取，結果發現乙腈、異丙醇提取效率較低(回收率僅50%);正己烷極性太小，制得的供試品溶液油脂含量較大，可能導致固相萃取柱過載，且正己烷揮發性過強，可能影響進樣精密度;而采用乙酸乙酯提取，回收率相對較好，富集泵可對SPE 小柱有效凈化，減少不同樣品間干擾;加入無水硫酸鈉可對樣品溶液進行脫水處理，進一步減少干擾。

色譜柱選擇

富集柱選擇：為了盡可能減少油脂成份在SPE 小柱上的洗脫時間，提高分析速度，優選Acclaim C8 作為在線SPE 柱。分析柱選擇：分別選擇Hypersil Gold C18、Accucore C18、

Acclaim Phenyl-1 色譜柱對樣品和對照進行分離，結果發現Acclaim Phenyl-1(苯基柱)分析，苯并[a] 芘峰形最好，與其他雜峰的分離最佳，故最終選擇Acclaim Phenyl-1 色譜柱作為分析柱。

方法的重現性

取濃度為1.068 μg/ml 的對照品溶液重復進樣5 針，保留時間RSD 為0.04 %，色譜峰面積RSD 為0.96 %。制備加標量5 μg/kg 的供試品溶液5 份，分別進樣1 針，保留時間RSD 為0.07 %，色譜峰面積RSD 為2.40 %。

圖5. 加標樣品重復性測定色譜圖。

線性、檢出限

取不同濃度苯并[a] 芘標準工作溶液依次進樣10 μl 分析，在0.107 ng/ml ~ 53.89 μg/ml 范圍，以苯并[a] 芘濃度和峰面積進行線性回歸，標準曲線為A = 8254.2783 C + 208.3219，

相關系數1.0000。取濃度為0.107 ng/ml 的苯并[a] 芘對照品溶液，進樣3 μl分析，苯并[a] 芘峰高值約為噪音值三倍，本方法檢出限為0.3 pg(按對照品進樣量折算);最低檢出濃度為0.15 μg/kg(按供試品取樣量折算)。

圖6. 方法檢測線測定色譜圖。

實際樣品的分析

取市售的樣品，分別照GB/T 5009.27-2003 和本方法進行測試，結果見表4。

表4. 樣品檢測結果

取5# 樣品進行加標回收試驗(色譜圖見圖5)，加樣回收率均在95 %~105 % 之間，平均回收率為98.51 %，RSD =2.40 %(n = 5)，說明本方法的準確度較高;采用國家標準GB/T 5009.27-2003(提取凈化后的樣品溶液采用紙色譜分離，熒光分光光度計測定)未能檢出樣品中苯并[a] 芘，初步推測是由于該方法靈敏度相對較低所致。

結論

本方法使用在線固相萃取方法對臘肉香腸中苯并[a] 芘進行測定，操作簡便易行，減少了手動操作步驟，提高了方法重現性和準確度，適用于該類樣品的快速檢測。