還原糖和總糖的測定3,5二硝基水楊酸比色法

一、目的

掌握還原糖和總糖測定的基本原理，學習比色法測定還原糖的操作方法和分光光度計的使用。

二、原理

還原糖的測定是糖定量測定的基本方法。還原糖是指含有自由醛基或酮基的糖類，單糖都是還原糖，雙糖和多糖不一定是還原糖，其中乳糖和麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。利用糖的溶解度不同，可將植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來，對沒有還原性的雙糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有還原性的單糖進行測定，再分別求出樣品中還原糖和總糖的含量（還原糖以葡萄糖含量計）。

還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖酸及其它產物，3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內，還原糖的量與棕紅色物質顏色的深淺成正比關系，利用分光光度計，在540nm波長下測定光密度值，查對標準曲線并計算，便可求出樣品中還原糖和總糖的含量。由于多糖水解為單糖時，每斷裂一個糖苷鍵需加入一分子水，所以在計算多糖含量時應乘以0.9。


 

三、實驗材料、主要儀器和試劑

1. 實驗材料

小麥面粉；精密pH 試紙。

2. 主要儀器

（1）具塞玻璃刻度試管：20mL×11

（2）大離心管：50mL×2

（3）燒杯：100mL×1

（4）三角瓶：100mL×1

（5）容量瓶：100mL×3

（6）刻度吸管：1mL×1；2mL×2；10mL×1

（7）恒溫水浴鍋

（8）沸水浴

（9）離心機

（10）扭力天平

（11）分光光度計

3. 試劑

（1）1mg/mL 葡萄糖標準液

準確稱取80℃烘至恒重的分析純葡萄糖100mg，置于小燒杯中，加少量蒸餾水溶解后，轉移到100mL 容量瓶中，用蒸餾水定容至100mL，混勻，4℃冰箱中保存備用。

（2）3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑

將6.3gDNS 和262mL 2M NaOH 溶液，加到500mL含有185g 酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5g結晶酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1000mL，貯于棕色瓶中備用。

（3）碘-碘化鉀溶液：稱取5g碘和10g碘化鉀，溶于100mL蒸餾水中。

（4）酚酞指示劑：稱取0.1g酚酞，溶于250mL70%乙醇中。

（5）6M HCl 和6M NaOH各100mL。

四、操作步驟

1. 制作葡萄糖標準曲線

取7支20mL 具塞刻度試管編號，按表1分別加入濃度為1mg/mL 的葡萄糖標準液、蒸餾水和3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑，配成不同葡萄糖含量的反應液。

                             表1 葡萄糖標準曲線制作

2. 樣品中還原糖和總糖的測定

（1）還原糖的提取

準確稱取3.00g 食用面粉，放入100mL 燒杯中，先用少量蒸餾水調成糊狀，然后加入50mL 蒸餾水，攪勻，置于50℃恒溫水浴中保溫20min，使還原糖浸出。將浸出液（含沉淀）轉移到50mL 離心管中，于4000r/min下離心5min,沉淀可用20mL 蒸餾水洗一次，再離心，將二次離心的上清液收集在100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，混勻，作為還原糖待測液。

（2）總糖的水解和提取

準確稱取1.00g食用面粉，放入100mL三角瓶中，加15mL蒸餾水及10mL 6M HCl，置沸水浴中加熱水解30min（水解是否完全可用碘-碘化鉀溶液檢查）。待三角瓶中的水解液冷卻后，加入1 滴酚酞指示劑，用6mol/LNaOH 中和至微紅色，用蒸餾水定容在100mL容量瓶中，混勻。將定容后的水解液過濾，取濾液10mL，移入另一100mL容量瓶中定容，混勻，作為總糖待測液。

（3）顯色和比色

取4支20mL 具塞刻度試管，編號，按表2 所示分別加入待測液和顯色劑，空白調零可使用制作標準曲線的0號管。加熱、定容和比色等其余操作與制作標準曲線相同。

五、結果與計算：

計算出7、8號管光密度值的平均值和9、10管光密度值的平均值，在標準曲線上分別查出相應的還原糖毫克數，按下式計算出樣品中還原糖和總糖的百分含量。